组织培养实验指导书

组培器皿及器械的洗涤、灭菌及环境的消毒一、试验目的组织培育用境的消毒方法。二、试验原理试验仪器及器械的清洗、消毒和灭菌是组织培育成功的关键所在，是外植体杀菌作用，同时易被蒸馏水冲洗掉。条件下进展。三、试验操作步骤〔一〕器皿与用具的洗涤1、玻璃器皿的洗涤1%稀HCL1用过的玻璃器皿，用清水冲洗，蒸馏水冲洗一次，干后备用即可。透亮发亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。2、金属用具的洗涤水冲洗后，擦干备用。用过的金属用具，用清水洗净，擦干备用即可。3、每人清洗局部玻璃器皿备用。→晾干→浸入酪酸洗液〔一种强氧化剂，去污力量强，配制方法：重铬酸钾40500ml450ml〕，浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。洗液，以后的步骤同前。〔二〕玻璃器皿、用具及环境的灭菌、玻璃器皿和用具的灭菌承受干热灭菌法：子等金属器具，用纸包好，放进电热烘干箱，当温度升至100℃时，启动箱内鼓120min〕,到达灭菌目的。承受高压蒸汽灭菌法：15～20烯、聚甲基戊烯等类型的塑料用具也可以进展高温消毒。灼烧灭菌：承受灼烧灭菌，将镊子、解剖刀等从浸入95%酒精中取出，置于酒精灯火焰上灼烧、放凉、使用，操作完毕后，用具应擦拭干净后再放置。2、环境的消毒地面、墙壁和工作台的灭菌20%洁尔灭〔苯扎溴铵〕溶液倒入喷雾器中，对接15～30min，一般紫外线消毒后不要马上进入，应在15-20min无菌室和培育室的灭菌2：10.5%空间。试验报告将本次试验内容整理成试验报告。试阐述为什么要对器皿和用具进展严格的洗涤和灭菌？试验二培育基母液的配制与保存〔MS〕一、试验目的与母液的保存方法。二、试验原理备培育基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。三、试验仪器、用具及试剂〔一〕电子天平〔感量为0.0001g、0.01g〕,烧杯〔1000ml，100ml，50ml〕、量签、冰箱。〔二〕试剂IAA、IBA、NAA、6-BA、2,4-D、GA、KT、蒸馏3水、重蒸馏水。四、试验步骤与方法的化学反响，如Ca2+和SO2-,Ca2+,Mg2+和PO3-一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙4 4的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应承受化学纯或分析纯按培育基上的排列挨次混合。Skoog,1962)为例表达如下：(一)、大量元素母液〔10〕的配制MS5〔表1-1〕，依据培育基配方的用量，各1050ml30-40ml5挨次1000ml〔也可将钙盐与镁盐单独配成母液存放〕，将配好的定容1000ml1L100ml。表1-1 Murashige和Skoog大量元素的称量及定容化合物名称

培育基配方用量(mg/L)

10(mg)用于定容KNO3190019000NHNO4 3165016500MgSO·7HO(无水MgSO4 2 4370〔190〕3700〔1900〕KHPO2 41701700CaCl·2HO(无水CaCl2 2 2440〔330〕4400〔3300〕〔二〕、微量元素母液〔浓缩100〕的配制MS培育基配方中微量元素共有7种〔表1-2〕，按表中称取用量，用感量为0.0001g1000ml1L1L10ml。1-2微量元素母液各化合物用量化合物名称MnSO·4HO(MnSO·HO)

培育基配方用量(mg/L)22.3(16.9)

100(mg)用于定容2230(1690)4 2 4 2ZnSO·7HO4 28.6860CuSO·5HO4 20.0252.5HBO3 36.2620NaMoO·2HO2 4 20.2525KI0.8383CoCl·6HO2 2

0.025

2.5(三)、铁盐母液〔200〕的配制0.01g2.78g3.73g在200ml蒸馏水中，两种溶液混合定容至500ml，用棕色广口瓶盛装，贴标签，10以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。1L5ml。(四)、有机物母液〔100〕的配制MS份有维生素和氨基酸〔1-3〕1-3100ml。贴标签，放入冰箱保存。1L10ml。1-3有机物母液的称量化合物名称VB1VB〔盐酸吡哆醇〕5VB〔烟酸〕6肌醇甘氨酸

培育基配方用量(mg/L)0.40.50.51002

100(mg)4.05.0(NaOH5.0(NaOH100020〔五〕、生长调整物质〔激素〕母液的配制〔浓度1mg/ml〕这样配制培育基时只要稍加计算，按需要量取即可。3NA，吲哚乙酸〔IA〕,赤霉素〔GA，2，4-D等生长素和玉米素〔Z〕395%酒精助溶，然后再加蒸馏水定容至刻度。感动素〔KT〕6-苄〔见2。50mg，并先用相应的少量有机溶剂1.0mg存于冰箱保存〔0~4℃〕。0.5ml母液即可。存温度过低时会产生针状结晶〕，觉察有沉淀或霉团时，则不能连续使用。五、试验报告1、将本次试验内容整理成试验报告。2、制备母液时应留意哪些问题？为什么？PHMS吸取量，填入下表：1-5MS药品名称大量元素微量元素铁盐VB1VB〔烟酸〕6

MS需要量0.4mg/L0.5mg/L

母液浓度1010005ml/L1mg/L1mg/L

配制 培育基母液吸取量/ml1000ml 500ml 300mlVB〔盐酸吡哆醇〕0.5mg/L5

1mg/L甘氨酸2mg/L2mg/L肌醇100mg/L20mg/L2，4-D0.5mg/L1mg/LKT1mg/L0.5mg/L蔗糖20g/L琼脂8g/LPH5.8试验三MS一、试验目的二、试验原理进展分析、比较、试验，选择一个符合试验材料需要的适宜培育基。物质和有机附加物等五类物质组成。三、试验仪器、用具及试剂〔一〕试验仪器、器皿及用具酸度计〔300ml500ml、1000ml〕、封口膜等。〔二〕试剂MS0.1NNaoH0.lNHCl、琼脂、蔗糖、蒸馏水。四、试验步骤与方法〔一〕培育基的配制与分装1、计算各种母液的用量〔1000mlMS〕依据配方计算母液用量，以此配方为例：1LMS+2，4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂，PH=5.8。30g8g。2、每组取50ml〔不能混用〕，量取或吸取各种母液，放于烧杯中，同时加上激素，备用。31000ml300ml8g，在石棉网30g1000ml。4pH:PHPHPH0.1NHCI0.1NNaOH5.8。5、培育基分装、封口：把配制好的培育基趁热分装到培育瓶中，培育基应时间等。〔二〕培育基的灭菌的环节。培育基灭菌的方法有多种，这里主要用的是高压蒸汽灭菌法。1、高压蒸汽灭菌法0.5kg/cm2，扭开放气阀排出冷气，使压力表指针回复零1.1～1.2kg/cm2时，将火调小，保持15～20min121℃15～20min)，切断电源，缓慢放出蒸汽，即手套。高压蒸汽灭菌留意事项：空气的存在并达不到应有的温度因而影响灭菌效果。长会使一些化学物质遭到破坏影响培育基成分，时间短则达不到灭菌效果。基会喷溢，造成培育瓶和包头纸的污染。2、干热灭菌法洗涤。把组织培育的培育皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进展彻底清洗。150℃温度下，干热灭1h，120℃2h。灭菌完毕，待冷却后取出。五、完成试验报告11000ml〔培育基配方：3%蔗糖+0.8%琼脂〕。先配母液，再配培育基，灭菌，备用。2、高压灭菌时应留意哪些事项？3、计算以下培育基各种母液的用量〔ml〕。培育基 MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+2%蔗糖(1000ml)

1/2MS+NAA1.5mg/L+6-BA2.0mg/L+5%蔗糖(1000ml)

MS+NAA1.0mg/L+6-BA2.0mg/L+3%蔗糖(500ml)大量元素微量元素有机物Fe盐6-BANAA蔗糖(g)试验四外植体的消毒与灭菌一、试验目的体的灭菌方法、接种前的预备工作和接种技术。二、试验原理时，既要将材料上附着的微生物杀死，同时又不能伤及材料。常常使用的灭菌剂有酒精〔70～75%〕、次氯酸钠、过氧化氢、漂白粉、溴灭菌后，汞离子在材料上不易去掉，必需将材料用无菌水多清洗几次。用时需要考虑使用浓度和处理时间。三、试验仪器、用具及试剂〔一〕试验仪器、器皿及用具剪刀、镊子、洗衣粉、毛笔、工作服、拖鞋、记号笔、香皂。〔二〕试剂70%酒精、2.0%次氯酸钠、10%次氯酸钙，0.1%升汞、无菌水四、试验方法步骤1、外植体的采集幼嫩部位。2、外植体的预处理6～24〔因材料种类不同而定〕。3、外植体的灭菌：在超净工作台上进展。0.1%lOmin，10～l5min，浸泡时可进展搅动，使植物材料与3～5〔1〕花药的灭菌外面有萼片、花瓣或颖片、稃片包裹着，通常处于无菌状态。所以一般用70%酒2310min，2.0%10min，0.1%升汞处理5-10min3～5〔2〕果实及种子的灭菌依据果皮或种皮的软硬结实程度及干净程度而异。10min2310%的次氯酸钙或0.1%～0.2%升汞浸泡20～30min或数小时，或者常规消毒后无菌水浸泡30min至数小时。另外也可以用砂布打磨、温水或开水浸煮5min左右以软化种皮。进展胚或胚乳培育时，可去掉坚硬的种皮后进展常规消毒。茎尖、茎段、叶柄及叶片的灭菌肥皂水等进展洗涤，然后用自来水长时间流水冲洗〔0.5～2h〕，之后用吸水纸70%酒精漂洗。然后，依据材料的老、嫩和枝条的坚硬程度，用6～15min，0.1%5～15min，用无菌水3～5根和贮藏器官的消毒，再用刀切去损伤或难以清洗干净的部位，用吸水纸吸干后用70%酒精漂洗一下，再用0.1～0.2%的氯化汞浸泡5～10min，或用2～8%次氯酸钠溶液浸5～渗入，可使外植体彻底消毒。五、试验报告1、如何对外植体材料进展消毒灭菌处理？2、对外植体材料进展消毒灭菌应留意哪些问题？试验五、外植体的无菌操作技术〔接种〕一、试验目的作技术。二、试验原理直接利用和消耗植物材料，导致组织坏死直至失去培育价值。三、试验材料与用具〔一〕材料任意一种植物的茎尖。〔二〕试验仪器、器皿及用具〔试验四〕〔或干热灭菌器〕、酒精喷壶、天平、脱脂棉、记号笔、白大褂、工作帽、拖鞋等。〔三〕试剂70%的酒精、95%的酒精、无菌水、2%次氯酸钠四、试验方法步骤〔一〕无菌操作前的预备工作1、培育室、无菌操作室的清扫和灭菌(参照试验二)2、配制培育基〔参照试验四〕3、培育基、接种工具等灭菌〔参照试验二〕〔二〕3Omin。〔三〕30min〔四〕工作人员接种前用香皂洗净双手，一般洗两次，于缓冲间内穿上灭菌〔〕带进接种室。〔五〕70%的酒精棉球擦拭〔或喷雾〕工作台和双手。〔六〕将接种器械及其它所用物品放进工作台〔将初步洗涤及切割的材料放取出放置在灭过菌的枯燥滤纸上〕。〔七〕70%酒精擦拭〔或喷雾〕培育瓶，然后解开并拿走培育瓶封口膜，使培育瓶倾斜，并将瓶口置酒精灯火焰区，转动瓶口烘烤数秒钟。〔八〕左手将培育瓶几乎水平拿着，用右手拿镊子夹一块植物材料〔灭过菌5-10操作期间应常常用70%酒精擦拭〔或喷雾〕工作台和双手；接种器械应反复95%的酒精中浸泡和在火焰〔或干热灭菌器〕上灭菌，以防止穿插污染。〔九〕在培育瓶外标清培育基编号、培育材料、接种日期，送入培育室。五、完成试验报告3，5～8/瓶。接种一周后，观看接种材料的污染状况，并分析发生污染的缘由。2、无菌操作的技术关键是什么？3、接种时应当从哪些方面避开污染？试验六园艺植物的茎尖、茎段培育及微体快速生殖技术一、试验目的通过本次试验，娴熟把握外植体的外表灭菌方法，并稳固把握无菌操作的物微体快繁培育基的设计和配制。二、试验原理植物茎尖处于比较幼嫩的部位，其细胞具有旺盛的生命力，易于培育而获几十微米的茎尖分生组织〔获得无病毒苗，较大的可利用几十毫米的茎尖甚至茎尖，以带有叶原基的生长为宜，这样既能提高成活率，又能加快生殖速度。三、试验材料及用具〔一〕试验材料〔葡萄、杨树、月季、香石竹、兰花〕优良单株的嫩茎切段，也可以用顶芽或侧芽。〔二〕设备、仪器及用具培育瓶〔三〕试剂BWhite70%0.1%1mg/mlIBA1mg/ml6-BA、51mg/mlNAA、无菌水四、试验内容试验材料的筛选与处理外植体的诱导增殖培育五、方法和步骤〔一〕试验材料的筛选与处理基、继代培育基和生根培育基。2、培育基的配制：参照试验四3、试验材料的筛选与灭菌处理各试验小组在查阅文献资料的根底上，分别选择易于培育的任意一种园艺植物的嫩茎切段5～10cm,除去叶片，流水冲8～10mins，3～4滤纸吸干外表水分，备用。〔二〕外植体的诱导增殖培育10.5～1.0cm105～624～26℃、2023～4000lx16h。培育15～20天后，可见一些绿色的芽点和不定芽消灭，再培育一段时间后，将消灭丛生苗。23～410瓶，于培育室内培育。3、无根芽苗的生根培育：待幼芽长至3～4cm长时，从芽丛基部剪下并切六试验结果与分析〔每瓶依据接种外植体数量分别统计，并分析造成污染的缘由。2、统计继代培育试管苗的增殖率，并分析激素种类和浓度对试管苗增殖的影响。分化培育基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.02mg/L。试验七花药的离体培育技术一、试验目的二、试验原理有的植物花药培育还能有效脱除母株所带病毒，获得无病毒苗。三、试验材料与用具〔一〕试验材料2～3〔二〕设备、仪器及用具培育瓶、纱布、塑料袋、三角瓶、冰箱、显微镜、醋酸洋红、载玻片、盖玻片、各种灭菌、接种、培育用具和器皿等〔三〕试剂51mg/LNAA、无菌水。四、试验内容完成花药的预处理、灭菌、接种及培育过程。五、试验方法和步骤〔一〕镜检确定花粉发育期：确定花粉适宜发育时期。〔二〕材料预处理3～5℃3～5〔三〕培育基制备MSN6

〔3～6%〕1的分化培育基〔3%〕〔配制方法参照试验四〕。〔四〕花药灭菌及接种花蕾用自来水及蒸馏水冲洗干净后在无菌条件下用75%的酒精浸泡10～20s8～15min→3～5干水分→取出花药接种于诱导培育基中〔留意不要破坏花药〕，每瓶接种20～3010〔五〕初代培育1500～2023lx14h25～28℃，以诱导形成胚状体或愈伤组织。〔六〕诱导分化及再生，诱导再生植株。六试验结果与分析并比较分析两种诱导培育基对花药培育的影响。2、观看并记录愈伤组织的分化状态，统计分化率。附录一、酒精稀释简便方法=稀释后的体积分数×稀释后的体积95%70%95%酒精70m〔稀释后的酒精体积分数数值，加蒸馏水至95m〔原酒精体积分数数值70%的酒精。附表二、常用生长调整剂物质和维生素特征表相对名称缩写分子式溶剂分子量2,4-二氯苯氧乙酸2,4-DCHOCl863 2221.04乙醇〔2,4-dichlorophenoxyaceticacid〕吲哚乙酸(indole-3-aceticacid)IAACHNO109 2175.181mol/LNaOH3－吲哚丁酸(indole-3-butyricacid)IBACHNO1213 2203.231mol/LNaOHα－萘乙酸(α-naphthaleneaceticacid)NAACHO12102186.201mol/LNaOHβ-苯氧乙酸〔β-naphthoxyaceticacid〕β-NOACHO12103202.201mol/LNaOH腺嘌呤〔adenine〕A，Ad，AdeCHN·3HO555 2189.13HO2硫酸腺嘌呤〔adeninesulphate〕AdSO硫酸腺嘌呤〔adeninesulphate〕AdSO4(CHN)·HSO·2HO5552 2 4 2404.37HO26-苄基腺嘌呤BA，BAP，6-BACHN225.261mol/LNaOH(6-benzyladenine,benzy-laminopurine)12115异戊烯基腺嘌呤(2-isopentenyladenine)2ip,IPACHN10135203.251mol/LNaOH(Kinetin)KTCHNO1095215.211mol/LNaOH玉米素〔Ziatin〕ZT,Zt,ZCHNO10135219.21mol/LNaOH噻苯隆〔thidiazuron〕TDZ220.2乙醇赤霉素(gibberellin,gibberellicacid)GA3CHO346.4乙醇脱落酸〔abscisicacid〕ABACHO15204264.31mol/LNaOH(colchicine)CHNO2225 6399.4HO2化合物成分培育基KCl65化合物成分培育基KCl65750AlCl30.03KNO3801900250095028301900190019Na·EDTA·2HO2237.3MOO30.001NHNO4 316507201650120049KHPO2 41706840017034017NaNO3600NaSO2 4200(NH)SO42 4134463FeNa·EDTAWhiteMSB5NitschN6MTHellerERRM(1963)(1962)(1966)(1969)(1974)(1969)(1953)(1965)(19MgSO·7HO4 275037025018518537025037037NHPO·2HOa2 4 219150125CaCl·2HO2 24401501661664407544040Ca(NOCa(NO)·4HO32 2300FeSO·7HO4 227.827.827.827.827.827.Na·EDTA237.337.337.337.337.337.D-甘露糖醇MnSO·4HO4 2522.3254.422.30.12.2322.MnSO·2HO4 210KI0.750.830.750.80.830.01D-甘露糖醇MnSO·4HO4 2522.3254.422.30.12.2322.MnSO·2HO4 210KI0.750.830.750.80.830.010.8FeCl·6HO3 21NiCl·6HO2 20.03CoCl·6HO2 20.0250.0250.0250.00250.0ZnSO·7HO4 238.62101.518.6CuSO·5HO4 20.010.0250.0250.0250.0250.030.00250.0HBO3 31.56.23101.66.210.636.2NaMoO·2HO2 4 20.250.250.250.0250.2Fe(SO)2 432.5Sequestrene330Fe28肌醇(CHO)612610010010010010烟酸〔VB〕50.050.5150.50.50.50.5盐酸吡哆醇〔VB〕60.010.510.50.50.50.50.5甘氨酸〔CHNO〕25 2322222叶酸0.5生物素0.05＆Skoog(1964)；KC：Kundson(1946)；6：朱自清等〔1974。附录四、常用植物生长激素浓度单位换算μmo/L(10-3mmol/L,μmo/L(10-3mmol/L,1-6mol/L)mg/LNAA2,4-DIAAIBABAKTZT2ipGA315.3714.5245.7084.9214.4394.6474.5614.9202.887210.7419.04811.4179.8418.8799.2939.1229.8405.774316.11213.5