大鼠脊髓损伤BBB评分中文版

Westernblot试验操作步骤一、 蛋白样品制备1用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉），用吸管将其吸至离心管中2用4°C预冷的PBS1ml冲洗培养瓶2次收集入上述离心管中3lOOOrpm，离心10min4倒掉上清，沉淀用lmlPBS重悬，转入EP管中，再加lmlPBS冲洗离心管壁上残留的细胞转入EP管中5 4°C,4000rpm,离心5min6倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净）7配制裂解液，计算所需用量，每个EP管中加入lOOul裂解液（10mg组织/lOOul）若有4管（4组），配制400ul裂解液：PMSF储备液浓度lOOmM,用RIPA稀释至lMm.【单去污剂裂解液（PMSF）：lmol/LTris・HCl（pH8.O）2.5ml;NaCl0.438gTritonX-1000.5ml;蒸馏水至50ml;混匀后4°C保存】4°C裂解30-45min,每5min振荡一次4C14000g离心5min,取上清（移入1.5ml的EP管中）。10蛋白定量（常用BCA法，参见蛋白定量试剂盒使用说明）每管蛋白一致，分装约2Oul/管左右（加入5xbuffer并用RIPA稀释成lx）11将蛋白样1OOC，变性5min,-8O°C（or-2OC）保存。二、 SDS的配制：1试剂及配制：（1） 3O%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g,N,N-亚甲基双丙烯酰胺lg,去离子水至lOOml,过滤，避光，4°C贮存。（2） 1.5mmol/LTris溶液（PH8.8）：称取18.15gTris碱（分析纯）加适量的超纯水溶解，用浓盐酸（分析纯）调pH值至8.8,加超纯水定容至1OOml,室温储存。（3） l.Ommol/LTris溶液（pH6.8，:称取12.1gTris碱（分析纯）加适量的超纯水溶解，用浓盐酸（分析纯）调pH值至6.8,加超纯水定容至1OOml,室温储存。（4） 1O%SDS：lgSDS加入lOml去离子水，室温贮存。（5） 1O%过硫酸铵溶液：O.lg过硫酸铵加入lml水，4°C保存，现用现配。（6） TEMED（可购买成品）（7） 5X电泳缓冲液（Tankbuffer）：称取15.14gTris碱（分析纯）,72.1g甘氨酸（分析纯）,5gSDS（分析纯），加适量的超纯水溶解，pH值应该在8.3左右，加超纯水定容1000ml，室温储存。（8） 分离胶、浓缩胶液配方：（两个用小烧杯，用完立即刷）总体积5ml2ml5ml浓度12%分离胶5%浓缩胶10%分离胶水(ml)1.61.41.930%丙烯酰胺（ml）2.00.331.71.5mmol/LTris溶液(pH8.8)(ml)1.3——1.31.0mmol/LTris溶液(pH6.8)(ml)—0.25—10%SDS(ml)(透明)0.050.020.0510%过硫酸铵溶液（ml）0.050.020.05TEMED（ml）（铺胶前加）0.0020.0020.0022.制胶程序：（小分子量）（1） 装板（小玻璃朝外）（2） 配制分离胶，加TEMED后，充分混匀，立即注入玻璃板间隙，从一边开始，并为浓缩胶留足够空间（梳齿长约1cm）。立即覆盖蒸馏水至顶部，天冷可放入烤箱15-20分钟,待分离胶聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳,避免气泡出现。（3） 待聚合后（约20分钟），拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽的前后槽，在加样孔中加入10-20ul样品（蛋白量20ug左右）。左侧第一孔加maker，样品不够可用laodingbuffer。电泳：接通电源，浓缩胶80伏约半小时，此后分离胶120/160伏继续1小时左右。三、转膜：1、转移缓冲液的配制：（先用先配）试剂用量甘氨酸14.413gTris碱3.0285g无水甲醇40-200ml（蛋白量150以上加40）水至10002、转膜程序：（1） 剪4张滤纸，和一张PVDF膜，大小与凝胶相同（滤纸要比胶小，膜稍大以防转膜时发生短路）。在膜的一角做一记号（或剪角）。（2） 将剪好的膜依次序浸入100%甲醇（10秒）一去离子水（5min）f转移缓冲液（大于10min）。（3）滤纸和海绵（纤维）垫浸入转移缓冲液中（大于10min）（4） 剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号。（5）安装转膜装置：从正极（红色）一负极（黑色）依次为：白色边盒一多孔垫片一（1~2张）滤纸一PVDF膜一凝胶一（1〜2张）滤纸一多孔垫片一黑色边盒。扣上吊扣后插进转膜槽中。转膜槽内加冰盒，防止电泳时过热。（6） 接通电源：恒流电转移两个小时，电流一般是100mA（视蛋白大小而定）。（7） 电泳结束后，关闭电源，将膜取出。四、封闭及免疫反应（一）试剂的配制：1.5xTBS：（PH7.5）用时稀释5倍试剂1000ml用量Tris-base6.05gNaCl43.83g去离子水至1000ml1xTBST：1xTBS+0.05%Tween-20试剂1000ml用量Tween-200.5ml1xTBS1000mlBlockingbuffer：1xTBST+5%DryMilk试剂100ml用量DryMilk5g1xTBST100ml（二）、免疫反应程序：取膜（平头镊子，玻璃平皿），放入10mlBlockingbuffer（封闭缓冲液），室温轻摇2h,或4°C过夜。一抗孵育，用TBST配制，1:1000（比例须看说明书，装入塑封袋中赶净气泡后用封口机封口），室温摇床上孵育1h后4°C过夜。用TBST室温洗膜10minX3次二抗孵育。用Tbst稀释，1:2000（比例须看说明书，方法同上），室温轻摇45min-2h。用TBST洗膜10minX3次。五、显影：1试剂（1） 超敏发光液（ECL）（A、B液等比混合）（2） 显影液：显影粉（按说明书配制）（3） 定影液：定影粉（按说明书配制）2显影程序（1） 发光液工作液的配制：等体积混合适量A液（200ul）和B液（200ul）,视膜大小而定，直接在保鲜膜上混合。（2） 显色反应：将膜取出，用吸水纸略吸去过多的液体（切勿接触膜的蛋白面），然后置于保鲜膜上，浸入并与发光液均匀充分地接触。（3） 压片检测：将膜固定于暗盒内（蛋白面朝胶片）。暗盒内放入胶片，压片曝光。（压片时间要摸索，15s-过夜）（4） 显影：胶片放入显影液，观察显影情况。（时间视显影情况而定）（5） 定影：胶片放入定影液，2-10min。流水冲洗，干燥保存六、ECL膜再生1试剂膜再生液：（500ml）SDS：10g；Tris：3.62g （Tris碱）；H2O：400ml调PH值6.7；定容至500ml；加250卩甲-巯基乙醇。2膜再生程序：（1） TBST洗膜10minX3次（2） 用时将膜浸在膜再生液中，60°C水浴30min（摇床）（3） TBST洗膜10minX3次（4） 封闭液封闭BBB法脊髓损伤的行为学评分评估大鼠后肢运动功能的恢复情况。将动物放置于平台上,观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分分三部分第一部分为0—7分，评判动物后肢各关节活动第二部分为8一13分，评判后肢的步态及协调功能第三部分为14一21分，评判运动中爪的精细动作，三项满分为21分.定义：将动物放入一开口盆中，轻敲盆壁，使其爬行，观察动物的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况。0无可观察到的后肢运动1或2个后肢关节轻度活动，一般为髋关节/膝关节。1个后肢关节大幅运动和另一关节轻度活动2个后肢关节大幅运动所有3个后肢关节轻度活动2个后肢关节轻度运动和第3个关节大幅运动2个后肢关节大幅运动，第3个关节轻度活动所有3个后肢关节大幅运动不负重摆动，或足底着地，但不负重仅站立的时候足底负重或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行

偶见负重步行，但前、后肢不协调由频繁到持续负重步行，但无前、后肢协调由频繁到持续负重步行，偶见前、后肢协调由频繁到持续负重步行，频繁前、后肢协调101112131415161718192021持续协调足底步行，优势爪在刚触地和抬起时旋转频