生产用种细胞鉴定的相关

生产用种细胞鉴定的相关检测技术摸索与把握1、前言

在历史上，由于细胞源性的生物制品存在外来的污染物或出于对用于制备产品的细胞性质方面的考虑，引发了一些对产品质量的关切。重组DNA(rDNA)制品的质量也与细胞基质中构建的表达载体有关：由此，人们用连续传代培育的细胞生产生物技术产品及生物制品的最大优点是使每批基质(或细胞库)用于生产，摸索与把握生产用种细胞鉴定的相关检测技术并必需重建立细胞库，这将延误产品上市或开发的时机。2、目前的生产用种细胞库及其检测技术现状分析生产部门各车间虽储藏了一些细胞资源，有细胞库的存在，但不完善，比方一些细胞只有粗略简洁的记录〔冻存人和日期，对于其传代的稳而在实际生产中，由于生产用细胞存在外来污染物给生产带来了不小的影的污染。由于竞争养分成分及支原体代谢产物的毒性作用，细胞生长活性受到影响，胞变圆并从培育瓶壁上脱落等，很大程度上影响生产以及苗毒质量的提高。例如08年的蓝耳生产，由于组织了相关提高蓝耳毒价系列试验，对其工艺状态不好，病毒生殖不抱负。后取细胞样送检，均支原体阳性，足见其对生产造成的影响是不容无视的。能最终定论，而我公司在固体培育基的支原体检测技术方面不太成熟。细胞系鉴定和检测的一般原则：对建系细胞基质的鉴定和检测是生物(如来自于宿主的毒素或抗生素)进展评估。检测的目的是为了证有用于生产的细特性(如生长的需求)、它的培育历史(如人源和动物源性的生物试剂的使用)还要对每一个工作细胞库作纯度和有限的鉴别试验,而我们在这一块存在检测漏洞,故在此对相关检测技术进展开展和完善.3、目的与意义质量奠定根底。4、试验方案4、1方案一 支原体培育基的配制及其检测试验试验目的种细胞是否受支原体污染，以能观测到典型支原体菌落为阳性判定标准。试验人员：试验时间：91日——1230日试验方法检测方法一直接购置猪鼻支原体合成培育基按其使用方法进展检测检测方法二依据《中华人民共和国兽用生物制品规程》进展检测材料与器材材料:猪鼻支原体菌种、制备培育基相关药品器材:小试管、长吸管、锥形瓶、玻璃棒、天平、量筒、烧杯、平皿、正压不锈钢滤器、除菌滤膜、高压灭菌锅、pH计、显微镜、移液枪、二氧化碳培育箱培育基的制备液体培育基PPLO肉汤粉葡萄糖21g5g10%精氨酸溶液10ml1%醋酸铊溶液10ml25%酵母浸出液100ml10MEM10ml8万单位/ml青霉素溶液10ml猪〔马〕血清100ml1%酚红溶液1ml双蒸水1000ml1mol/LpH7.8，过滤除菌，定量分装，置固体培育基PPLO肉汤粉21g葡萄糖5g1%醋酸铊溶液10ml25%酵母浸出液100ml琼脂粉15双蒸水1000ml2-8℃保存备用。添加成分固体培育基 100ml血清 10ml8万单位/ml青霉素溶液 1ml10%精氨酸溶液 2ml10倍MEM 1ml使用前将琼脂培育基加热溶解，当温度降到60℃左右添加关心成分。检测方法液体培育基培育 取待检样5ml，接种小瓶液体培育基中，再从小瓶中取0.2ml移植接种于一小管液体培育基中，将小瓶与小管放37℃培育，分别于接种后5日、10日、15日从培育瓶中取0.2ml培育物移植到小管液体培育基内，每日观看培育物有无颜色变化，假设无变化，则在最终一次移植小管观看14日后，观看在观看期内假设觉察小瓶或任何一支小管培育物颜色消灭明显变化，在原pH值变化达±0.5时，应马上移植于小管液体培育基和固体培育基，观看液体培育基中是否消灭恒定的pH变化及固体上有无典型的煎蛋状支原体菌落。固体培育基培育 在每次液体培育物移植小管培育的同时，取培育物0.1ml在液体培育基颜色消灭变化在原值变化达±0.5时也同时接种琼脂平板每5-7日在低倍显微镜下观看检查各琼脂平板有无支原体菌落消灭经14日观看仍无菌落者停顿观看。每次检查时需设阴、阳性比照，在同条件下培育观看。结果判定 被接种物的任何一个琼脂平板上消灭支原 体菌落，判阳性。假设阳性比照中至少一个平板消灭支原体菌落而阴性比照中无支原体生长则检验有效。备用检测方法一1.配方KM2液体培育基EaglesMEM 450mL／L1％醋酸铊12．5mlML酵母浸出粉1．0g／L0．4％酚红1．75mL／L1mol／LNaOHpH7．6—7．8(121℃)15min420万单位／L310mL／L、灭菌安康猪血清200mL/L2.方法培育培育。每日观看其颜色变化，并与阴性比照进展比较。每3天传代13-4(15000／rain02mol／L的PBS缓冲液中。姬姆萨氏染色法230mJn100X倍显微镜下观看。.鉴定试验染色镜检检。一般培育基生长将传代的单菌落液体培育基接种一般肉汤琼酯板，湿盒37℃培育。兔血培育基生长湿盒37℃培育吸附红细胞20rnin，用生理盐水洗涤2～3次。生化试验葡萄糖细菌微量发酵生化鉴定管(北京路桥技术有限责任公司)，37培育。备用检测方法二配方一种高效支原体培育基根底培育基：9.0-11.0ｇ颖牛肉提取纯粉９．０－１１．０ｇ氯化钠４．０－６．０ｇ磷酸二氢钾０．４－０．６ｇ蒸馏水１０００ｍｌ液体培育基内还加有：生牛血清９０－１１０ｍｌ９０－１１０ｍｌ１０％尿素溶液或１０％精氨酸溶液５－１５ｍｌ０．４％酚红溶液４－６ｍｌ青霉素５００－２０００ｕ／ｍｌ固体培育基内还加有：琼脂１．２－１．４％备用检测方法三1、配方：支原体肉汤培育基成分加量猪胃消化液500ml牛肉浸〔粉〕液500ml酵母浸液5.0g氯化钠2.5g葡萄糖5.0g酚红0.02g将上述成分混合溶解，分装于玻璃管中，每支8ml121℃高压灭菌15min备用。基。13.0-15.0g琼脂即可。2、检查操作方法：〔或支原体固体培育基10支。操作程序0.22ul除菌滤膜滤后备用10-15min完全溶化，56℃左右备用。按无支原体灭活小牛血清：12.5万单位/ml青霉素=20：1的比例混合〔假设是分别原体用，可按无支原体灭活小牛血清：1.2%醋酸铊：12.5万单位/ml青霉素=2：2：1，参加到支原体肉汤培育基及56℃左右支原体半流体培育基或固体培育基中〔牛血清、醋酸铊青霉素的使用终浓度分别为17%、、2023U/ml)2.0ml.cell参加到上述预备好培育基中，每份样品接种支原体半流体培育基及支原体肉汤培育基〔固体培育基〕40.5-1.0ml,置〔36±0.5〕℃培育21天，每三天观看一次，留两支比照同等条件下培育。2支进展传代培育〔另1.0ml,置〔36±0.5〕℃21天，每三天观看一次。结果判定试验成立。培育基比照阴性，试验成立，结果有效。阴性。试验到期接种样品的初种及转种培育基〔8支〕均无支原体生长。复试。如疑有支原体生长，应取加倍量供试品在上述2种培育基上进展〔1.0-2.0ml)经复试后无支原体生长则判合格。疑经复试后仍有支原体生长，则为阳性结果，判定供试品被支原体污染。备用检测方法四1、配方1LPPLO肉汤粉 21g酚红 0.02g马血清 200ml15%酵母浸出液 100ml10×MEN培育液 100ml600ml蒸馏水中加热搅拌溶解，121℃15min200ml马血清10ml/4℃一个月。固体培育基1LPPLO肉汤粉21g酚红0.02g细菌琼脂15g蒸馏水600ml马血清200ml15%酵母浸出液100ml10×原液100ml热溶解，121℃15min灭菌，放入5050℃时于无菌操作台15%100ml10×原液，混匀5ml/培育皿，4℃，1个月。2、操作步骤37℃培育1-20.1ml液体培育液3周，持续观看有无菌落消灭。另取取1mlcell培育液或0.2mlcell悬液涂抹于固体培育基上cell的颖培育基。4、2方案二 细胞核型分析4、2、1目的与意义,将特定的细胞系用于疫苗生产前,必需对细胞进展全面的鉴定,其中细胞的核型分析是鉴定的重要组成局部,,,为物IBRS-2细胞不同代次的染胞进展代次使用状况的监控与把握。31日试验人员:4.2.3 试验材料细胞:IBRS-2原始细胞来源于生产细胞库，根底细胞、工作10代细胞均由本组自行传代培育。药品:甲醇,分析纯,;冰醋酸,分析纯,沈阳市欣西试剂厂;Giemsa,BIOBASIC公司产品。器材:离心机、离心管、载玻片、盖玻片、显微镜等4、2、4试验方法(80%集合),参加秋水372～3h后,用常规方法消化,转入离心管中,8min,0.5%KCl溶液悬浮细胞,3720min,参加颖固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)1mL,混匀,2min,8min,2mL,混匀,30min,8min,4mL颖固定液,20min,,据悬液中细胞密度大小,留取适量固定液,吸打均匀45°倾斜,用吸管将载玻片拂过酒精灯几次,观看,假设细胞能均匀的铺展,中期相不重叠,则用同样细胞浓度样品多制备几份样品。否则要进一步稀释细胞悬液,或者调整滴片高度,以到达满足的铺片效果。用Giemsa染色,Giemsa9PBS(pH=6.8)混合配成染色液(现用现配)15～30min,流水冲冼(冲片子的反面),水漂洗,晾干。Giemsa染色法：染液制备Giemsa充分混合，研磨至无颗粒；233ml纯甲醇，保存于棕色瓶内。(以盖片培育法或涂片法为例)pH6.8PBS1：9GiemsaPBS缓冲液混合配成染色液；把染色液布满玻片上(留意不要有气泡，用染色缸染色亦可)；染10～15分钟后，用自来水冲去玻片上多余的染料，空气枯燥、二甲〔70ml蒸馏水中〕光学树脂胶封固。结果胞核染成紫红色或蓝紫色，胞浆染成粉红色。留意事项：染色液宜现用现配，保存时间最好不超过48小时，旧染液染色效果不好。另外GiemsapHpH值要调准确，否则染色层氧化膜(发亮)，这层氧化膜易附在片上形成污秽，且不易除掉。因此在水直接冲掉多余染液。,周缘清楚的中期分裂10×100倍显微镜下照相,进展剪贴、排序，对分裂对长度,leven(1964)标准划分染色体形态。4、2、5结果与分析4、3方案三 外源病毒检测4.3.1目的与意义学习并把握对生产用细胞进展外源病毒检测的相关检测方法,看其是否受污染,对已受污细胞进展排查.30日试验人员：试验方法依据《中华人民共和国兽用生物制品规程》检测方法进展检测将待检细胞冻融后,过滤除碎片.Vero细胞单层(100cm2),1ml.连传两代,每代7日