第四章目的基因的制备连接导入与基因文库的构建详解演示文稿

第四章目的基因的制备连接导入与基因文库的构建详解演示文稿目前一页\总数一百三十五页\编于十一点优选第四章目的基因的制备连接导入与基因文库的构建目前二页\总数一百三十五页\编于十一点目的基因设计需要考虑的问题基因的长度及引物的设计限制性酶切位点的去处与添加去除基因内部正反向重复序列使用宿主偏爱的密码子添加起始与终止密码子添加表达所需特殊序列，如信号肽、调整阅读框、核糖体结合位点等目前三页\总数一百三十五页\编于十一点PCR法cDNA法鸟枪法

化学合成法目的基因制备方法目前四页\总数一百三十五页\编于十一点1化学合成法化学合成法的基本战略化学合成的单元操作DNA化学合成的用途目前五页\总数一百三十五页\编于十一点1.1.1全基因合成化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：小片段粘接法：混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

1.1化学合成法的基本战略目前六页\总数一百三十五页\编于十一点补钉延长法：混合退火根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

Klenow酶聚合目前七页\总数一百三十五页\编于十一点大片段酶促法：混合退火根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体

Klenow酶聚合目前八页\总数一百三十五页\编于十一点上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%目前九页\总数一百三十五页\编于十一点1.1.2探针等寡聚核苷酸合成在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此时需要从已知的氨基酸序列推测为其编码的DNA序列，然后合成探针，筛选由鸟枪法或cDNA法得到的重组子，最终获得含有目的基因的目的重组子由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必须考虑下列问题：生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针探针应具有足够的长度，通常在17-20个核苷酸之间探针内部不应出现可能的互补区域目前十页\总数一百三十五页\编于十一点探针等寡聚核苷酸合成某段连续的氨基酸序列CysMetAspGluMetLysArgAsnIle所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATACTGATGGGTTCCGACGGCGTCGC设计的简并探针序列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGAAG此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计expressedsequencetag目前十一页\总数一百三十五页\编于十一点1.2化学合成的单元操作化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的目前十二页\总数一百三十五页\编于十一点三氯乙酸化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基玻璃珠连接臂碘液四唑亚磷酰胺亚磷酰胺四唑活性中间体脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)目前十三页\总数一百三十五页\编于十一点1.3DNA化学合成的用途合成天然基因修饰改造基因

设计新型基因

制备探针、引物、接头

如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等

基因等目前十四页\总数一百三十五页\编于十一点2PCR法

PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物PCR法定向扩增目的基因的基本原理目前十五页\总数一百三十五页\编于十一点5‘5‘目的基因5‘变性加热5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加热变性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123目前十六页\总数一百三十五页\编于十一点由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆

PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR扩增产物T载体T7lacZMCSoriApr目前十七页\总数一百三十五页\编于十一点3cDNA法cDNA法克隆目的基因的基本战略cDNA法分离目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性目前十八页\总数一百三十五页\编于十一点cDNA法克隆目的基因的基本战略mDNAcDNA第一链的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs目前十九页\总数一百三十五页\编于十一点cDNA第二链的合成

煮沸NaOH自身引导法：获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1目前二十页\总数一百三十五页\编于十一点cDNA第二链的合成

DNApoldNTPsRNaesH置换合成法：获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligase目前二十一页\总数一百三十五页\编于十一点cDNA第二链的合成

dCTPTdT引导合成法：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPs目前二十二页\总数一百三十五页\编于十一点cDNA法克隆目的基因的基本战略双链cDNA的克隆

双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：

平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收

平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收

目前二十三页\总数一百三十五页\编于十一点cDNA法分离目的基因的基本程序完备分离程序

提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等目前二十四页\总数一百三十五页\编于十一点cDNA法分离目的基因的基本程序特异分离程序

提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等

目前二十五页\总数一百三十五页\编于十一点cDNA法分离目的基因的基本程序差异分离程序

利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能目前二十六页\总数一百三十五页\编于十一点差异分离程序

多瘤病毒感染的FR3T3细胞正常的FR3T3细胞总mRNA总mRNAcDNA双链cDNA单链cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二链克隆提取mRNA共价交联上柱原位杂交病毒诱导表达的基因cDNA克隆目前二十七页\总数一百三十五页\编于十一点cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构

细菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难仅限于克隆蛋白质编码基因

目前二十八页\总数一百三十五页\编于十一点4鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性目前二十九页\总数一百三十五页\编于十一点鸟枪法克隆的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离

目前三十页\总数一百三十五页\编于十一点鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断

超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端

全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接

如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞转化受体细胞

筛选含有目的基因的目的重组子

菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）

目前三十一页\总数一百三十五页\编于十一点鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA

目前三十二页\总数一百三十五页\编于十一点鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0

kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接在连接前将DNA片段进行分级分离

2.0kb1.6kb1.8kb目前三十三页\总数一百三十五页\编于十一点鸟枪法操作的改进冻融法吸附法：胶回收试剂盒低融点胶回收法电洗脱法法凝胶DNA片段回收技术

目前三十四页\总数一百三十五页\编于十一点鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构目前三十五页\总数一百三十五页\编于十一点第二节目的基因与克隆载体的体外重组粘性末端的连接（定向克隆法）平末端的连接同聚物加尾法加人工接头连接法加DNA衔接物连接法PCR产物的连接目前三十六页\总数一百三十五页\编于十一点一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起单酶切、双酶切目前三十七页\总数一百三十五页\编于十一点粘性末端连接法目前三十八页\总数一百三十五页\编于十一点定向克隆法优点:(1)载体及目的基因末端不互补，不会自身环化；(2)定向插入目的基因。注意事项：(1)载体及目的基因需要电泳纯化；(2)避免酶切不完全。目前三十九页\总数一百三十五页\编于十一点（一）直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’二、平末端（bluntend）的连接目前四十页\总数一百三十五页\编于十一点（1）同聚加尾法（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾－碱基互补目前四十一页\总数一百三十五页\编于十一点同聚物加尾法末端脱氧核苷酸转移酶目前四十二页\总数一百三十五页\编于十一点④缺点：③优点：能把任何片段连接起来操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。非酶切位点目前四十三页\总数一百三十五页\编于十一点（2）衔接物（linker）连接Linker：用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：（二）人工加尾形成“粘性末端”目前四十四页\总数一百三十五页\编于十一点（1）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接（3）限制性内切酶消化（4）目的片段与载体连接目前四十五页\总数一百三十五页\编于十一点加人工接头连接法优点：兼具同聚物加尾法和粘性末端连接法的优点；缺点：待克隆外源基因不能含有人工接头相同的酶切位点。人工接头DNA片段目前四十六页\总数一百三十五页\编于十一点（二）人工加尾形成“粘性末端”（3）DNA接头（adapter）连接法①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’目前四十七页\总数一百三十五页\编于十一点人工合成的寡链核苷酸加DNA衔接物连接法人工合成的寡链核苷酸含有粘性末端，因此需要防止其自身环化，通过在其粘性的5’末端进行脱磷酸修饰，使之彼此间无法连接。多核苷酸激酶目前四十八页\总数一百三十五页\编于十一点接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接②优点：连上后就能用。③缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。④防止自我连接5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’目前四十九页\总数一百三十五页\编于十一点Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-3’

GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5’HO-GATCCCGG-GGCC

CCGG-GGCCCTAG-OH5’5’HO-GATCCCGG3’GGCC-OH5’nick缺口nick缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化目前五十页\总数一百三十五页\编于十一点三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15～20bp与模板互补；5’端内切酶识别序列＋保护碱基避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。目前五十一页\总数一百三十五页\编于十一点三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点请设计一对PCR引物，在N端和C端分别加一个EcoRI（GAATTC，保护碱基GCA）和BamHI酶切位点（GGATCC，保护碱基CGC），另外，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列。写出P1和P2的引物序列。目前五十二页\总数一百三十五页\编于十一点带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC

PCR产物5’--3’CCTAGGCGC

PCR产物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoRI位点BamHI位点AATTC

PCR产物5’--3’CCTAG

PCR产物-5’3’-GGEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！目前五十三页\总数一百三十五页\编于十一点AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA三、PCR产物的连接2.与T载体直接连接目前五十四页\总数一百三十五页\编于十一点3、Gateway载体构建系统噬菌体位点特异性重组系统；

高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。入门克隆改造过的各种表达载体目前五十五页\总数一百三十五页\编于十一点第三节重组载体引入受体细胞物理法：基因枪法、电击法、超声法、显微注射法、激光微束法化学法：PEG法，脂质包埋法、磷酸钙、DEAE-葡萄糖等介导的DNA转染法载体介导法：质粒载体转化介导、农杆菌介导、病毒介导法目前五十六页\总数一百三十五页\编于十一点一、重组DNA导入大肠杆菌（一）转化（transformation）大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（三）转染（transfection）受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。（二）转导（transduction）借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。目前五十七页\总数一百三十五页\编于十一点（一）转化（transformation）（1）热激法（heatshock）（2）电转化法（electronporation）（3）PEG介导的原生质体转化（4）接合转化目前五十八页\总数一百三十五页\编于十一点制备感受态细胞增加受体菌细胞膜的通透性（1）热激法目的感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞目前五十九页\总数一百三十五页\编于十一点制备感受态细胞1、将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，处于感受态；2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；3、经42℃短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理

目前六十页\总数一百三十五页\编于十一点10ng载体DNA100L感受态细胞冰浴30min42℃1~2min加入1mLLB培养基（Amp-）37℃振荡培养1h10-100L转化液涂Amp＋平板吸附DNA摄入DNA操作步骤：（p140）转化率：106-108/gDNA目前六十一页\总数一百三十五页\编于十一点（2）电转化法

原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞“感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证电击过程中细胞不被击穿而死亡。转化率：109~1010/gDNA目前六十二页\总数一百三十五页\编于十一点目前六十三页\总数一百三十五页\编于十一点（二）转导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程（三）转染噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。与转化无本质区别体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。每gDNA能形成106个噬菌斑

现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染目前六十四页\总数一百三十五页\编于十一点

体外包装过程目前六十五页\总数一百三十五页\编于十一点病毒载体介导法:Fosmid载体的连接、重组与导入目前六十六页\总数一百三十五页\编于十一点二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞原生质体转化碱金属离子介导的完整细胞转化PEG1000转化法电击法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞目前六十七页\总数一百三十五页\编于十一点1.利用原生质体进行转化

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2

PEG插入外源基因的载体共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法转化转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%目前六十八页\总数一百三十五页\编于十一点

酵母0.1mol/LLiCl处理感受态2.碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体40%PEG4000热激涂布选择性平板，筛选转化子

吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转化率：103个

/g

DNA；共转化现象极少目前六十九页\总数一百三十五页\编于十一点4.电击转化（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个/gDNA（3）单链转化率高于双链3.PEG1000转化PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化目前七十页\总数一百三十五页\编于十一点PEG法将外源基因融合进入宿主目前七十一页\总数一百三十五页\编于十一点电击法将外源基因导入宿主目前七十二页\总数一百三十五页\编于十一点二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞载体介导的转化（农杆菌介导）DNA直接导入（基因抢法、电击法等）种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞目前七十三页\总数一百三十五页\编于十一点（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA目前七十四页\总数一百三十五页\编于十一点（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌目前七十五页\总数一百三十五页\编于十一点（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法通过农杆菌侵染植物外植体目前七十六页\总数一百三十五页\编于十一点（二）导入植物细胞1.农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株目前七十七页\总数一百三十五页\编于十一点在饲养平皿的滤纸上培养2天叶盘法的具体操作目前七十八页\总数一百三十五页\编于十一点T-DNA的染色体整合机制农杆菌介导法目前七十九页\总数一百三十五页\编于十一点共整合转化程序目前八十页\总数一百三十五页\编于十一点二元整合转化程序目前八十一页\总数一百三十五页\编于十一点又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。DNA1.2m钨弹头吸附金属微粒加速，进入受体细胞基因枪装入2.基因枪法（genegun）外植体制备轰击外植体培养及选择目前八十二页\总数一百三十五页\编于十一点目前八十三页\总数一百三十五页\编于十一点具体操作1.DNA微弹的制备2.外植体的制备3.DNA微弹轰击4.外植体的培养目前八十四页\总数一百三十五页\编于十一点植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液电击处理愈伤组织幼苗分化3.电击法（电穿孔法）选择培养目前八十五页\总数一百三十五页\编于十一点二、重组DNA导入真核细胞（一）导入酵母细胞1.磷酸钙沉淀法2.脂质体介导法3.显微注射法4.DEAE-葡萄糖转染法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞目前八十六页\总数一百三十五页\编于十一点原理：（三）导入动物细胞1.磷酸钙沉淀法通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。目前八十七页\总数一百三十五页\编于十一点目前八十八页\总数一百三十五页\编于十一点操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。目前八十九页\总数一百三十五页\编于十一点2.脂质体介导法脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。目前九十页\总数一百三十五页\编于十一点目前九十一页\总数一百三十五页\编于十一点应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.显微注射法1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段2）收集受精卵：受孕后几小时内3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植目前九十二页\总数一百三十五页\编于十一点目前九十三页\总数一百三十五页\编于十一点二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖转染法葡聚糖葡聚糖目前九十四页\总数一百三十五页\编于十一点DEAE-dextran外源DNA细胞混合DEAE-dextran对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。4.DEAE-葡萄糖转染法目前九十五页\总数一百三十五页\编于十一点目前九十六页\总数一百三十五页\编于十一点转化率及影响因素转化率（cfu

/μgDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。（一）转化率的计算：转化率＝产生菌落的总数/DNA的加入量目前九十七页\总数一百三十五页\编于十一点转化率及影响因素例：取1μl（0.1ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？转化率＝1000

/0.01ngDNA=108cfu/μg目前九十八页\总数一百三十五页\编于十一点例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107cfu/mg天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？104＝107cfu/mg×10-2×a×20%重组载体a=0.5mg目前九十九页\总数一百三十五页\编于十一点普通的亚克隆实验：1×106cfu/μgDNA；更复杂的亚克隆：1×107cfu/μgDNA，如有限量的DNA的转化，T-A克隆；构建文库：>1×108cfu/μgDNA。目前一百页\总数一百三十五页\编于十一点1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度2）受体细胞3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率（二）转化率的影响因素目前一百零一页\总数一百三十五页\编于十一点一、载体表型选择法二、根据插入基因的表型选择三、DNA电泳检测法四、PCR检测法五、核酸杂交检测法六、免疫化学检测法七、DNA序列分析第四节重组子的筛选与鉴定目前一百零二页\总数一百三十五页\编于十一点重组子的筛选直接筛选间接筛选DNA鉴定载体筛选翻译产物转录产物其他方法（报告基因等）NorthernblottingWesternblotting标记补救筛选质粒载体的α互补筛选（蓝白色斑筛选法）噬菌体包装容量的正性筛选质粒载体的抗性标记筛选同源性分析鉴定（原位杂交）DNA序列分析重组子酶切图谱鉴定重组子大小鉴定目前一百零三页\总数一百三十五页\编于十一点1.抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI。一、载体表型选择法目前一百零四页\总数一百三十五页\编于十一点2.-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝+深蓝色目前一百零五页\总数一百三十五页\编于十一点-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。目前一百零六页\总数一百三十五页\编于十一点利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。二、根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长目前一百零七页\总数一百三十五页\编于十一点例：抗生素抗性抗性基因载体外源DNA连接转化受体菌抗生素培养基平板含抗生素抗性基因的克隆才能生长使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状目前一百零八页\总数一百三十五页\编于十一点有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。1.直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。三、DNA电泳检测法Marker载体重组克隆目前一百零九页\总数一百三十五页\编于十一点2.酶切电泳筛选法根据外源DNA序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶切割，电泳后比较电泳结果：DNA带数和长度。一般用重组时的内切酶将外源DNA切出单双目前一百一十页\总数一百三十五页\编于十一点目前一百一十一页\总数一百三十五页\编于十一点四、PCR扩增检测法应用PCR反应扩增出预期DNA片断（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）；（2）用外源DNA插入片断引物作PCR；（3）凝胶电泳；（4）是否有条带产生，条带大小是否正确。目前一百一十二页\总数一百三十五页\编于十一点五、核酸杂交检测法1.Southernblotting从宿主细胞中提取DNA，用探针杂交。目前一百一十三页\总数一百三十五页\编于十一点2.Northernblotting主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，用探针杂交。目前一百一十四页\总数一百三十五页\编于十一点3.Westernblotting在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。①（SDS）点样电泳方向目前一百一十五页\总数一百三十五页\编于十一点膜胶蛋白②转膜③杂交待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗④检测3.Westernblotting目前一百一十六页\总数一百三十五页\编于十一点4.原位杂交筛选目前一百一十七页\总数一百三十五页\编于十一点利用抗体作为“探针”，检测产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。六、免疫化学检测法对表达产物的检测。蛋白－蛋白“杂交”放射性抗体检测与菌落杂交相似目前一百一十八页\总数一百三十五页\编于十一点DNA测序是最为准确的重组子鉴定方法，可以鉴定重组克隆序列是否准确无误。七、DNA序列分析目前一百一十九页\总数一百三十五页\编于十一点（1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（β-D-glucuronidase，GUS）；（2）细菌和萤火虫的荧光素酶（Luciferase）；（3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因（GreenFluorescentProtein）。植物转化体报告基因（reportergene)筛选报告基因：基因载体上引入的一些可证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来的具有特殊标志意义的基因。目前一百二十页\总数一百三十五页\编于十一点第五节基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序目前一百二十一页\总数一百三十五页\编于十一点基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库（genepool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）

基因文库（genelibraryorgenebank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因）存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）

目前一百二十二页\总数一百三十五页\编于十一点基因文库的基本概念基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库目前一百二十三页\总数一百三十五页\编于十一点基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小

例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆目前一百二十四页\总数一百三十五页\编于十一点基因文库的基本概念基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选目前一百二十五页\总数一百三十五页\编于十一点基因文库的构建程序基因组DNA的制备为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，

用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高AAAA用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000kb大小的DNA片段目前一百二十六页\总数一百三十五页\编于十一点基因文库的构建程序基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超