乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测

乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的监测

缪晓辉2009.5一、HBV耐药的有关定义二、各种耐药检测技术的评价三、需要重视的几个问题一、HBV耐药的有关定义

病毒学突破（virologicbreakthrough）病毒反跳（viralrebound）生化学突破（biochemicalbreakthrough）HBV基因型耐药（genotypicresistance）HBV表型耐药（phenotypicresistance）临床耐药（clinicalresistance）HBV耐药的有关定义

病毒学突破（virologicbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。HBV耐药的有关定义

病毒反跳（viralrebound）指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治疗前水平。

HBV耐药的有关定义

生化学突破（biochemicalbreakthrough）指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。HBV耐药的有关定义

HBV基因型耐药（genotypicresistance）指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。HBV耐药的有关定义

HBV表型耐药（phenotypicresistance）通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。通常以IC50来评估IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐药IC50

＞10倍:耐药HBV耐药的有关定义

临床耐药（clinicalresistance）指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBVDNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。二、各种耐药检测技术及评价病毒学反跳或突破的监测HBV基因型耐药监测HBV表型耐药检测临床耐药监测病毒学反跳或突破的监测基于对血清HBVDNA载量的动态监测需重视以下三点：1.HBVDNA载量检测手段的敏感性2.检测技术的可靠性和稳定性3.监测的间隔时间HBV基因型耐药监测时机非必须不主张常规、广泛应用基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异

在HBV多聚酶序列中的位置HBV基因型耐药的主要技术碱基序列分析法直接测序克隆测序聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)反向杂交分析技术（INNO—LiPA）基因芯片技术实时荧光定量PCR技术探针定点突变PCR技术引物末端碱基定点突变扩增技术熔解曲线法基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)直接测序法末端终止法化学裂解法DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。①简便、快速、准确可靠。②安全、无放射性污染。③模板用量大大减少。④测序能力增强。HBVYMDD变异直接测序结果图谱直接DNA测序的局限性1.设备贵、技术高、耗材、费时。2.必须有充足目的基因片段。3.突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBVYMDD变异1.JPG克隆测序法克隆测序法优点：1.有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株之间的相对比。2.提高了检测的灵敏度。局限性：1.技术难度较高。2.检测周期更长。3.检测的费用大大增加。碱基变喷异可能氏导致：①原有谜位点消失②产砖生新的舌位点③识饺别位点著移位利用错配吊引物使漫P亏CR产物冻中产生禾特袭异的酶切杰位点结果:寄酶切恐片段长件、短变散化和多狸、少变鸣化聚合酶付链式反货应及限讲制性片李段长度跳多态性闷技术(杂PCR枯-RF令LP)限制性内携切核酸酶托的作用它们能夕识别D者NA的月特异序接列，并伶在识别最序列内及或其旁烫切割双仁链DN骂A。如神：Nde拿I限制酶冻的识别瘦序列和鉴切割位象点：CATAT臣G--砌-薄GTA费TA萄C--饺-Nla牌Ill限制酶的泉识别序列盈和切割位跳点：腥CAT挽GN彩NN-封--G馋TAC浓NNN-菌--PCR哥-RF盘LP检乔测HBV挑YM轻DD变异PCR错配引物陶设计PCR-味RFLP盲检测HBV转YM潜DD变异PCR预-RF吼LP检卫测HBV互YM雁DD变异PCR-普RFLP迁技术的评烂价优点：简单、广帝泛易开展懒。缺点：1.限制裂性内切酶痰种类有限沫。2.错配哨引物将导蠢致退火温撤度降低、巾非特异条全带增多。3.引吸物非完帜全匹配秀，可能桑导致扩黄增效率巷降低、杂检测敏感的夹下降。反向杂蛇交分析坐技术（虾INN详O—L河iPA射）INN弱O—L眉iPA仗诊断H凝BV尺YMD朗D变异DNA咱芯片技卵术BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray“Hy兰bri剖diz怠e”arrayerMicr病oarr顺ayf娃abri口cati繁onSam扁ple主pr哨epa甘rat双ionMole物cula该rhy咐brid浩izat穿ionDet定ect哑ion奸an理d倘ana罚lys胸isDNA虫芯片技坚术诊断手HBV怨YM诊DD变激异Dete蔽ctio雨nof剥YMD螺DMo谅tif畏Muta拳nts惑byO牲ligo跑nucl钥eoti番deC研hips裕in荐Lam续ivud疤ine-签Untr粱eate脆dPa懒tien刻tsw农ith最Chro专nic棕Hepa牛titi皮sB坏Viru鱼sIn反fect胖ion。JK爽ore争an餐Med佣Sc架i2鸭004衬;1离9:讯541皮-54寸6.DNA攀芯片技绸术优点辫局限性大通量耽技术和档设备的要锦求高快速沸检考测成本破高灵敏度蓬高可平行检转测实时荧许光定量抢PCR森在基因密变异中仅的应用探针定点禽突变PC举R技术-督杰Taqm辽an-M唤GB探针引物末踢端碱基浸定点突冈变扩增摧技术高分辨熔舅解曲线法Taq袄man亭-MG恶B探针居定点突馋变PC韵R技术Taqm睡an-M草GB探针祖技术检测YM酒DD变异HBV乒DN卡A>1芦05cop倍ies过/mlW:M央=1:坑1HBV肠DNA>即105copi怜es/m凝lW:M=嗽10:1HBV怨DN才A<1询05cop岩ies臂/mlW:M=蹄10:1：W：M探针定点青突变PC悠R技术优点辉不民足灵敏度居高需要相愿对较贵游的荧光跃PCR为仪特异性举好需要多条救荧光探针益，成本高费时短影响因素早多，存在粪一定误判引物末溉端碱基狱定点突盯变扩增乐技术引物末端拌碱基定点皆突变扩增蝴技术

检仓测YMD兆D变异熔解曲突线法检福测YM男DD变普异特异性谢探针，驱其Tm溉值不同溶解曲掏线分析基质辅教助激光挽解吸电秒离飞行薪时间质烦谱(M挠ALD馒I-T兆OF史MS)会原理MAL武DI-斥TOF拼MS五检测鬼HBV抓YM锡DD变阔异的原冷理酶切分子简量.JP乐G基质辅助渡激光解吸鹿电离飞行星时间质谱构(MAL盘DI-缸TOF败MS)优点：高灵敏煮度、准励确度、割分辨率能发现宪相对比浸例小于巷1%的它变异株陆。局限性美：设备昂贵蛾，目前国真内难以用已于临床检共测。HBV耐机药不同检妹测技术的框比较Adv猎anc赴es阔in遮Mol壁ecu佛lar规Di植agn吨osi繁so注fH新BV侨Inf蒙ect捕ion柱an愿dD消rug柿Re稀sis勉tan袋ce。Int.莲J.组Med.穷Sci存.2005肾2(1醉)：8-摆161Sen假siti咸vity架her想ere染fers西to砖the辨lowe哗stl醉evel飘(%)吧at葱whic贼han哀ass贯ayc准and屯etec猾tmi辜xtur拣eso框fmu皆tant巾and郑wil型d-ty恼pev械irus搁.2I销nfor蛛mati遇onc加onte累nti袜sco懒nsid颠ered呜as属ame小asur惜eof述at滑est’漆sab连ilit呆yto字pro毒vide屋bro型ad,胸rele蒸vant州inf封orma产tion森abo抖utp纺ossi陷ble处new晋muta艺tion肯s.3俱Upda趋teab饼ilit可yas耀sess肤est约hee婶ase恰atw巷hich蛛at驶est副can等be橡dapt旗edt炉oin勾corp杯orat腐eth豆ede明tect三ion知ofa学new意mut铲atio今n.n栽a,n阴ota狱ppli厉cabl饼e.n糕d,n滑otd埋eter脾mine斩d.HBV羽表型耐叠药检测有两种断途径：1.细锣胞外H栋BV聚粥合酶活庭性分析套。2.细筋胞药物旧敏感性存实验。细胞外悲HBV港聚合酶询活性分间析目前常用乖的研究H看BV聚合莫酶活性模融型是将H此BV基因输组插入杆遵状病毒载喊体，继而么转染昆虫贿细胞而表泛达HBV序颗粒，应嗽用亲和层油析法纯化陪HBV颗悦粒后，在断细胞外评校价药物对蛾聚合酶活偶性的影响荷。细胞外H乐BV聚合锐酶活性分输析细胞药物蚀敏感性实介验该方法穷类似于慨细菌药桨物敏感曲试验。桶目前多养采用病葵毒载体递将含有幅被检测汇的含H税BV变颤异位点领的全基温因组导忍入肝细上胞源性戚细胞株召，然后煮将各种挤浓度的萍核苷类疼药物加酿入培养姑液，经沉过一定乏时间培苦养后检堆测细胞纠上清中悼的HB牵VD宏NA含劳量。细胞药圣物敏感倡性实验细胞药物候敏感性实戏验该技术罩在操作堂上非常厚繁琐，涛目前仅昼限于研蚀究之需报，主要蒜用于药浑物开发茧研究，染尚不能血用于常硬规临床施分析。临床耐盆药监测YMD舒D变异齐前后病涌毒载量奋和AL兼T的变极化HBV杆MDD变圈异与病毒肝学突破判断临床轻耐药时的狐建议1.结粘合核苷类狸药物的应漂用史、起翅始病毒载巾量、是否裙合并其他参肝病等。2.注意坦甄别依从跃性不良。3.结裤合基因屯变异位距点。三、需桥要重视瞒的几个萄问题慎重对待猜天然耐药阀的结论。不要过晓分依基貌因型耐扯药检测协技术。正确对待缘瑞基因分型充技术。YMD首D自然者变异的歪几组数薄据Akar路suM胜等采用I惯nnoL国ipa泰法检测7最1例未经劲抗病毒的旦成年慢性暗乙肝携带乓者，结果晨有13例款检测到Y请MDD变乔异株。Lee伯CZ蔑等采用蛛引物末蒸端碱基煎定点突毒变扩增谋技术对烦28例威拉米夫财定治疗米前的C猪HB患崭者血清俩进行了化YMD兵D变异夕毒株检走测，发腹现有1旧6例（文57.蒙1%）萍存在Y惹MDD片自然变蓝异毒株差。日本K赌oba妇yas刘hi等莲检测1构8例无栗症状H束BV携素带者,被发现5社例YM娘DD变任异,占形27.之78%银。本实验赤室关于阀YMD松D自然译变异饿的2组葛数据196例居CHB患绝者中，检裙出存在Y跳MDD变久异毒株者旅共21例名，检出率线为10.某7%。其倍中YVD爽D阳性2兵0例，Y鄙IDD阳召性1例，规YVDD茂和YID下D同时阳本性者0例抱。183亚