DB15T 2957-2023 马铃薯晚疫病菌PCR检测方法

发布发布内蒙古自治区市场监督管理局2023-05-262023-04-26ICS65.020.01CCSICS65.020.01CCSB16内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准DB15/T2957—2023马铃薯晚疫病菌PCR检测方法DetectionofpathogenicfungusforpotatolateblightbyPCRmethodDB15/T2957—2023DB15/T2957—2023DB15/T2957—2023DB15/T2957—2023目 次前言 II1范引文件 1语定义 11剂仪器 1试剂 1溶配制 2仪器 2作骤 2对的立 2取样 2马薯织品DNA提取 2PCR扩增 2脂凝电泳 3果定 3试成的件 3结判定 3IIIII前 言本文按GB/T1.1—2020《准工导则 第部分标化件结和起规》定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区马铃薯标准化技术委员会（SAM/TC40）归口。马铃薯晚疫病菌PCR检测方法范围本文件规定了马铃薯晚疫病菌PCR检测方法。本文件适用于马铃薯植株、块茎中晚疫病菌的检测。（GB/T6682 下列术语和定义适用于本文件。马铃晚病 potatolateblightPhytophthorainfestans(Montagne)deBary原理（PolymeraseChainITSDNA为模板，在TaqDNA用下进行PCR扩增，根据PCR试剂GB/T66822×TaqPCRMasterMix50×TAEDNAMarker、6×DNALoadingBuffer等均从试剂公司购买。122取样4℃冰箱中，DNADNA将样品置于灭过菌的研钵中，加液氮研磨成粉末，转至1.5mL离心管，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取。PCR扩增PCR在ITS序列区设计引物，引物序列如下：上游引物：5’-TGGGCGAGCCCTATCAAAA-3’。下游引物：5’-CGATTCAAATGCCAAGCTAA-3’。扩增片段大小为613bp。用超纯水将上、下游引物分别配制成工作浓度为10ng/μL的溶液。PCR马铃薯晚疫病菌PCR扩增反应体系如表1所示，按照以下顺序加入相应试剂到PCR管中，混匀并离心10s，使混合液都沉降到PCR管底。详见表1。（10mg/mL）称取溴化乙锭100mg，加水溶解，定容至10mL。1×TAE量取50×TAE电泳缓冲液20mL，加水定容至1L。1.0称取1.0100mL的1×TAE50℃左右时，加入5μL仪器PCR1180g～124704感量0.01g）。检测体系以马铃薯晚疫病菌的DNA作为阳性对照，以不添加DNA模板的反应体系作为阴性对照。33试验成立的条件阳性对照检测到预期大小的特异性扩增条带，阴性对照没有条带，表明试验有效。结果判定613bp8 使用1.05μLPCR1μL6×DNALoadingBuffer用DNAMarkerDNA7 表1 PCR增应系PCR反应物加入PCR反应体系的体积uLddH2O18.02×TaqPCRMasterMix4.0上游引物（10ng/uL）1.0下游引物（10ng/uL）1.0模板DNA1.0总体积2