生化实验质粒DNA提取

生化实验质粒DNA提取演示文稿目前一页\总数四十一页\编于十七点生化实验质粒DNA提取目前二页\总数四十一页\编于十七点2、严瑾型质粒：严瑾型质粒的复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过氯毒素等蛋白合成抑制剂来增加。目前三页\总数四十一页\编于十七点质粒类型质粒按复制方式可以分为两种类型：1、松弛型质粒：松弛性质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶，即使蛋白质合成受到抑制，质粒的复制依旧进行。目前四页\总数四十一页\编于十七点质粒的应用1、大多数基因工程使用的是松弛型质粒2、严瑾型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。3、质粒的特点使质粒成为外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因工具在基因过程中具有极其广泛的应用价值。目前五页\总数四十一页\编于十七点质粒的性质中与载体作用关系密切的包括：1、质粒的复制型

2、质粒的不相容性3、质粒的接合性4、多克隆位点

5、筛选标记目前六页\总数四十一页\编于十七点1、质粒能在细菌中垂直遗传，并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，1952年由Lederburg正式命名为质粒。目前七页\总数四十一页\编于十七点质粒特点质粒对细菌本身的生长繁殖不是必需的，但可以赋予细菌一定的表型，如抗药性等。

它是基因操作工程中常用工具中载体的一种。是携带目的DNA片段进入受体细胞进行扩增和表达的工具。目前八页\总数四十一页\编于十七点人工基因工程获得胰岛素首先获得胰岛素基因，再将胰岛素基因转入大肠杆菌内，再创造大肠杆菌增殖的有利环境，对大肠杆菌进行大规模培养，使之产生大量的治疗糖尿病的药物--胰岛素，提取纯化。目前九页\总数四十一页\编于十七点分离质粒DNA的方法从大肠杆菌中分离质粒DNA的方法众多，目前常用的有:1、碱裂解法2、煮沸法3、SDS法4、羟基磷灰石层析法……目前十页\总数四十一页\编于十七点这几种方法概括起来说主要采用非离子型或离子型去污剂，有机溶剂或碱进行处理及加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA目前十一页\总数四十一页\编于十七点选择哪一种方法取决于以下几个因素：1、质粒的大小2、大肠杆菌菌株3、裂解后用于纯化的技术和实验要求目前十二页\总数四十一页\编于十七点各种方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且回收效率高，提取的质粒DNA可用于酶切，连接和转化。目前十三页\总数四十一页\编于十七点质粒DNA的提取目前十四页\总数四十一页\编于十七点实验目的

掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各主要试剂的作用。目前十五页\总数四十一页\编于十七点质粒(plasmid)共价、闭合、环状的小分子量DNA；

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。实验原理目前十六页\总数四十一页\编于十七点质粒的复制类型

严瑾型:只在细胞周期的一定阶段进行复制，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1-2个质粒。

松弛型:质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制停止后，质粒仍然能继续复制，每个细胞中含有10-200个拷贝。目前十七页\总数四十一页\编于十七点载体(Vector)能自主复制；有克隆位点(外源DNA插入点)，常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；分子量小，以容纳较大的外源DNA.目前十八页\总数四十一页\编于十七点质粒提纯思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白质、基因组DNA、RNA

碱裂解法碱裂解抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。目前十九页\总数四十一页\编于十七点实验原理分析

碱性条件变性

质粒DNA染色体DNA目前二十页\总数四十一页\编于十七点碱裂解法在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。目前二十一页\总数四十一页\编于十七点1.手工碱裂解法抽提质粒5MKAC酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS和染色体DNA沉淀50mM葡萄糖,Tris·HCl(25mM,pH8.0),10mMEDTA分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活0.2MNaOH,1%SDS碱性水解细胞壁肽聚糖，核酸和蛋白质变性无水乙醇:除去DNA水化层，沉淀DNATE

(Tris

+EDTA)缓冲液:溶解DNA平衡酚:氯仿:异戊醇=25:24:1氯仿使蛋白质变性并分离水相与有机相。平衡酚使DNA在上清中(pH=7.8,酸性下DNA位于有机相，酚的密度大)。异戊醇可消除出现的泡沫。目前二十二页\总数四十一页\编于十七点对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解细菌离心取上清

(含质粒DNA)柱吸附(预处理柱)PW漂洗PD洗涤去蛋白EB溶解DNA质粒DNA溶液2.质粒提取试剂盒(离心柱型)最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜上洗脱。目前二十三页\总数四十一页\编于十七点目前二十四页\总数四十一页\编于十七点实验器材和试剂实验器材超净工作台、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、1.5mL离心管、加样枪、离心吸附柱、废液收集管目前二十五页\总数四十一页\编于十七点试剂1.含有质粒pCDA3.1的大肠杆菌DH5a2.LB液体培养基3.平衡液BL4.STE缓冲液(溶液P1)5.裂解液(溶液P2)6.NaAc溶液(3M,pH4.8)(溶液P3)7.去蛋白液PD8.漂洗液PW9.洗脱缓冲液EB10.RNaseA(10mg/mL)目前二十六页\总数四十一页\编于十七点溶液1：悬浮细胞，抑制DNASE溶液1:50mM葡萄糖25mMTris-HCL(PH=8.0)10mMEDTA(PH=8.0)葡萄糖：增加溶液的粘度，悬浮菌体，避免快速沉淀，维持渗透压，防止DNA受机械作用力而降解。EDTA:金属螯合剂，螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子，抑制Dnase对DNA的降解作用Dnase:脱氧核糖核酸酶它发挥作用时需要金属离子做辅基目前二十七页\总数四十一页\编于十七点溶液2：裂解细菌，变性DNA和少量蛋白质溶液2（新鲜配制）：0.2MNaOH1%SDSNaOH:破解细胞（瞬间溶解细胞膜，细胞膜发生从双层膜结构到微囊结构的变化），释放DNA，使蛋白质变性。DNA在5<PH<9的溶液中是稳定的，但当PH<3或PH>12时，就会引起双链之间的氢键解离而变性。溶液2中的NaOH的浓度为0.2M，加到提取液中时，该系统的PH>12，因而促使染色体DNA和质粒DNA的变性。为什么要新鲜配制？为什么采用NaOH?目前二十八页\总数四十一页\编于十七点SDS：是一种离子型表面活性剂，其主要功能是溶解细胞膜上的脂质和蛋白质，因而溶解膜蛋白，破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来，为后续处理需要。注意：1、处理时间不能过长；否则碱性条件下基因组DNA会慢慢断裂2、温柔混合；避免机械剪切导致已经变性的基因组DNA断裂SDS:十二烷基硫酸钠目前二十九页\总数四十一页\编于十七点溶液3：是大部分蛋白质和细菌基因组DNA沉淀溶液3（PH=4.8）：0.5M60mlKAC11.5ml冰醋酸28.5ml水本质上是KAC-HAC的缓冲液；用PH=4.8的溶液3是为了把强碱性的提取液调回至PH中性，使变性的质粒DNA能够复性并稳定存在目前三十页\总数四十一页\编于十七点KAC：SDS能与蛋白质结合，SDS能与KAC生产PDS，PDS的溶解度要比SDS低得多，从而使大部分的蛋白质与细菌基因组DNA一起沉淀，使沉淀更完全。另外可以中和核酸上的电荷，减小相斥力，有利于变性的大分子染色体DNA、RNA互相聚合而沉淀下来。为何加入溶液3之后出现大量的沉淀？这沉淀的本质是什么？这里还需把SDS除掉的原因是？目前三十一页\总数四十一页\编于十七点酚/氯仿/（异丙醇）：抽提去除蛋白酚：使蛋白质变性氯仿：水饱和酚比重略比水重，遇到高浓度盐，离心后酚想转移至上层，不利于含质粒水相的回收，加入氯仿可增重其比重，使酚-氯仿始终在下层，另外避免酚进入水相。异丙醇：让离心后上下层的界面更清晰，方便水相的回收为何不加氯仿，酚会大量进入水相？目前三十二页\总数四十一页\编于十七点无水乙醇：沉淀质粒DNA乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇和核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的DNA沉淀剂DNA溶液中DNA是以水和状态稳定存在的，当加入乙醇的时候，乙醇会夺取DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合RNaseA：使RNA降解，减少提取得到的质粒DNA中的RNA，以便减少对后续实验的影响。为何要用无水乙醇,加入两倍体积无水乙醇后，乙醇含量就变为了67%,，用95%的乙醇可不可以，无水乙醇的价格要比95%的乙醇价格要贵得多目前三十三页\总数四十一页\编于十七点实验步骤1、

细菌培养：将含有pQE30质粒的大肠埃希菌接种到TG110uL接种到10ml含氨苄西林(100μg/mL)的LB培养液中，37℃摇培过夜(10-12h).2、收集菌体：取1.5mL菌液转入离心管中↓10000rpm，1min弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清目前三十四页\总数四十一页\编于十七点3.悬浮细菌：将细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液p1中，涡旋震荡，彻底悬浮细菌沉淀。注意：细胞悬液必须悬浮均匀，无可见沉淀块，否则所提质粒DNA的纯度及所得率会大大降低。4.碱液裂解细菌：加200uL新配制的溶液P2，立即轻柔颠倒离心管6-8次。使管内内容物混匀，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置2min。5.中和与复性：加150uL用冰预冷的溶液P3，立即温和颠倒离心管数次。，使溶液p3在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中5min目前三十五页\总数四十一页\编于十七点6.离心沉淀：↓12000rpm,5min将含质粒DNA的上清转移到另一离心管中

7.去蛋白：加等体积酚-氯仿，剧烈振荡混匀，静置3min待其分层后，↓12000rpm,10min，将上层液体转入到另外一离心管中8、

乙醇沉淀质粒DNA：加入2倍体积的无水乙醇，震荡混合，静置5min使质粒DNA形成沉淀。↓12000rpm,10min,收集质粒DNA沉淀，弃上清液为何要2倍体积的无水乙醇目前三十六页\总数四十一页\编于十七点9.乙醇洗盐:质粒DNA沉淀里有一定量的盐分需要除去。加入1ml70%乙醇，轻缓摇动数次，↓12000rpm,2min,弃上清液10.溶解质粒DNA：

待残余乙醇挥发干净后，加30ulTE缓冲液(PH8.0）溶解沉淀，加2ulRaseA(10mg/ml),37度保温30min以去除RNA。所得质粒粒DNA置-20度保存备用。实验是不是还有缺陷，其中RNseA怎么除掉为何要加TE缓冲液，有什么好处？目前三十七页\总数四十一页\编于十七点DNA的保存1、短期贮存：4℃或-20℃存放于TE缓冲液中。TE缓冲液的pH与DNA贮存有关，pH=8,可减少DNA脱氨反应，pH<7.0,DNA容易变性。2、长期贮存：-70℃存置于TE缓冲液中,在DNA