结核病免疫学诊断新进展

结核病免疫学诊断新进展第1页，共49页，2023年，2月20日，星期四March24,2004,WorldTBdayWouldyoumindtocleanthisDirtyairbyyourlung?第2页，共49页，2023年，2月20日，星期四结核病人的全球分布第3页，共49页，2023年，2月20日，星期四第4页，共49页，2023年，2月20日，星期四结核菌形态学改变正常结核菌第5页，共49页，2023年，2月20日，星期四FIG.1.

EffectofanaerobiccultureonthemorphologyofM.

bovisBCG,M.

tuberculosis,andM.

smegmatis.(A)LongitudinalsectionofanM.

bovisBCGbacillusculturedanaerobicallyfor6

monthsshowingpronouncedcellwallthickening(somecytoplasmicdehydrationisevident).(B)TransversesectionsofM.

bovisBCGbacilliculturedanaerobicallyfor6

months.(C)Lackofcellwallthickeninginlow-ODaerobicallyculturedM.

bovisBCGbacilli.(D)NLSPCM.

bovisBCGbacillishowingtheabsenceofcellwallthickening.(EandF)CellwallthickeninginM.

tuberculosisfollowinganaerobicculturefor1

monthundermineraloil.(G)AerobicallyculturedM.

smegmatis.(H)M.

smegmatisbacilliexhibitingcelllysisfollowing35

daysofanaerobicculture.细胞壁增厚第6页，共49页，2023年，2月20日，星期四第7页，共49页，2023年，2月20日，星期四37c,4monthswithoutshakinginaloosecapedTube.细菌变小,呈颗粒状或椭圆状第8页，共49页，2023年，2月20日，星期四人体免疫第9页，共49页，2023年，2月20日，星期四第10页，共49页，2023年，2月20日，星期四结核性肉牙肿模型第11页，共49页，2023年，2月20日，星期四第12页，共49页，2023年，2月20日，星期四ESAT-6抗原的研究开发课题进展报告第13页，共49页，2023年，2月20日，星期四一）课题立项背景和意义课题２００２年８月立项，获卫生人才科技创新项目经费资助１５万元。第14页，共49页，2023年，2月20日，星期四全球结核病疫情感染人数2０亿年新增加患病人数8００万年结核病死亡人数

２００万第15页，共49页，2023年，2月20日，星期四中国结核病疫情2000全国流调感染率44.5%，结核患病率367/10万涂阳患病率122/10万估计全国有结核病人５００万TB，Averagedeathage55.2Y第16页，共49页，2023年，2月20日，星期四结核病诊断的冰山现象感染人群活动性病人总人口第17页，共49页，2023年，2月20日，星期四大量病人的诊断需要依靠结素试验第18页，共49页，2023年，2月20日，星期四存在的主要问题１，PPD不能区分卡介苗接种和结核菌感染。２，我国卡介苗接种率超过９０％。３，存在有大量过诊过治现象TB，Averagedeathage55.2Y第19页，共49页，2023年，2月20日，星期四９８年结核菌全基因测序的公布，为新诊断试剂的开发带来了希望！第20页，共49页，2023年，2月20日，星期四BCG在传代过程中删除了ESAT-6等基因，也就意味着，用它作诊断试剂，可以排除

卡介苗接种的干扰。BCGESAT-6CFP10RD1区TB第21页，共49页，2023年，2月20日，星期四二）课题已经取得的进展一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。二，动物实验三，人体试验。第22页，共49页，2023年，2月20日，星期四一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。１，质粒构建ESAT-6基因插入Vector;pQE30Primer’5-TTGGGATCCATGACAGAGCAG-3;:5-ATAAAGCTTCTATGCGAACATCC-3.PCRampliWcationsweredonewith35cyclesat94°Cfor1min,66°Cfor1min,and72°Cfor1min,followedbyaWnalextensionstepat72°Cfor2min,第23页，共49页，2023年，2月20日，星期四一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。2，筛选克隆第24页，共49页，2023年，2月20日，星期四一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。3，大量培养转基因大肠杆菌３７度封闭式摇床第25页，共49页，2023年，2月20日，星期四一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。４，蛋白分离与纯化系统P10纯化柱粉碎用硅酸粉NI你NAT分离柱第26页，共49页，2023年，2月20日，星期四一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。５，纯化出ESAT-6蛋白第27页，共49页，2023年，2月20日，星期四一，利用转基因技术，表达和纯化出了ESAT-6蛋白。６，SDS蛋白表达确认ESAT-6蛋白分子量约为６.５KD第28页，共49页，2023年，2月20日，星期四二，动物实验小鼠品系；ICR感染途径；H37Rv或BCG104CFU尾缘静脉内注射皮肤试验；感染四周后，PPD5u和ESAT-6蛋白2微克下肢脚垫内注射。以脚肿张直径为判断标准。１，动物模型第29页，共49页，2023年，2月20日，星期四二，动物实验２，实验结果PPDESAT-6PPDESAT-6108642(mm)ESAT-6在结核菌和卡介苗感染组皮试结果有明显差异。H37RvBCG第30页，共49页，2023年，2月20日，星期四三，人体试验。１，文献报道，活动性结核皮试结果和干扰素水平有正相关第31页，共49页，2023年，2月20日，星期四三，人体试验。2，外周血培养诱导干扰素实验操作程序第32页，共49页，2023年，2月20日，星期四三，人体试验。PPDESAT-6PPDESAT-6３，志愿者皮试及外周血培养试验。皮试干扰素测定用于皮试结果阳性率较低第33页，共49页，2023年，2月20日，星期四三，人体试验。２，志愿者皮试及外周血培养试验。PPD强阳性１０６例４,PPD强阳患者中ESAT-6诱导干扰素阳性率第34页，共49页，2023年，2月20日，星期四四，研究结论１，ESAT-6不能用于皮肤试验，因为人体试验显示了较低的阳性率。（因为特异高，敏感性就低）２，外周血培养，诱导干扰素实验，显示了良好的相关性。３，临床主要适用于菌阴结核病人的诊断。４，与PPD实验相比，可以缩短诊断时间，减轻病人痛苦，提高正确诊断率。避免过诊过治。第35页，共49页，2023年，2月20日，星期四三），课题的将来研究计划１，课题以开发试剂盒为目的，为避免技术泄密，不提倡发表论文。２，继续扩大实验样本，稳定实验条件。３，ELISA试剂盒，存有成本高，价格贵的缺点，难以在基层推广。我们希望与其他单位联合，进一步开发出操作简单，价格便宜的诊断试纸条。以便大面积推广使用。第36页，共49页，2023年，2月20日，星期四StudyonProinflammatoryandTh1/Th2CytokinesinTuberculosisCasesZHANGGuolong1,2MITSUYAMAMasao2DUChangmei1SHIRuiru1WANGJiangdong1GAOFeixu1XIEHongge11HenanAnti-TuberculosisInstitute,Zhengchou,Henan,China2DepartmentofMicrobiology,KyotoUniversitySchoolofMedicine,Japan第37页，共49页，2023年，2月20日，星期四

BACKGROUND

CytokinesproducedbymacrophagesandTcellsarebelievedtobeinvolvedinbothpathophysiologyanddiseaseoutcomeinhumantuberculosis.Amongvariouscytokines,interferongamma(IFN-g)appearstobethemostessentialonefortheresolutionofthedisease.IFN-gproductionisunderthecontrolofIL-12andIL-18releasedfromthecellsofmacrophagelineage.Th1/Th2balanceisbelievedtobeimportantfortheresolutionoftuberculosis.

Pneumonia,tuberculosisandtumorarethreemajordiseasesinlung,sometimestheirx-rayshadowsandsymbolsarequitesimilar,somecytokinesmightbeusefulfordifferentialdiagnosisThecytokinelevelsintheclinicalspecimenhavenotbeenexaminedwellinChinasofar,anditappearstobeusefultodeterminethelevelsofproinflammatorycytokinesandTh1/Th2cytokinesintuberculosiscasesinChina.第38页，共49页，2023年，2月20日，星期四

CytokinelevelsintheseraofpatientsIL-8TNF-aIL-12IFN-gIL-18RESULTS0.025.050.075.0100.0125.0150.0175.0200.0225.0250.0275.0300.0325.0350.0IL-6IL-8TNF-aIL-12IFN-gIL-18IL-10IL-4IFN-gRIL-12RTBCANCERHEALTHY2区間移動平均(TB)2区間移動平均(CANCER)2区間移動平均(HEALTHY)第39页，共49页，2023年，2月20日，星期四

Pro-inflammatorycytokinelevelsinsera0.020.040.060.080.0100.0120.0140.0IL-6IL-8TNF-acytokinelevel(pg/ml)TBCANCERHEALTHY**第40页，共49页，2023年，2月20日，星期四

0.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0IL-12IFN-gIL-18Cytokinelevel(pg/ml)TBCANCERHEALTHYTh1typecytokinesinthesera*****第41页，共49页，2023年，2月20日，星期四

IL-12receptorandIFN-greceptorlevelsinthesera0.050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.0450.0IFN-gRIL-12Rlevel(pg/ml)TBCANCERHEALTHY**第42页，共49页，2023年，2月20日，星期四

Th2cytokinelevelsinthesera******************第43页，共49页，2023年，2月20日，星期四

Comparisonofcytokinelevelsbetweendrug-resistantand-susceptibleTBcases0.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0IL-6IL-8TNF-aIL-12IFN-gIL-18IL-10IL-4IFN-gRIL-12R-DSTB****DRTB第44页，共49页，2023年，2月20日，星期四

ComparisonofcytokinelevelsbetweenSmear-positiveand-negativeTBcases0.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0IL-6IL-8TNF-aIL-12IFN-gIL-18IL-10IL-4IFN-gRIL-12RTB+