第十九章色谱法导论

第十九章色谱法导论任课教师:陈磊中药分析教研室CHROMATOGROPHY第1页，共68页，2023年，2月20日，星期三第十九章色谱法导论fundamentalofchromatographanalysis第一节概述generalizationofchromatographanalysis

色谱法chromatograph是一种物理或物理化学分离分析方法，特别适宜于分离多组分的试样，是各种分离技术中效率很高和应用最广的一种方法。它是利用各物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的。色谱的起源和发展:(1)起源:俄国植物学家茨维特（Tswett)在1906年使用的色谱原型装置如右图所示。色谱法的产生固定相、流动相、色谱柱第2页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱历史与发展第3页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱历史与发展(2)色谱的发展40年代50年代薄层色谱1941年Martin和Synge提出色谱塔板理论1952年Martin和James发明了气相色谱20世纪60年代末70年代初随着气相色谱的发展,高效液相色谱得到了飞快发展(3)色谱的发展趋势色谱—光谱联用技术GC-MS、GC-FTIR、LC-MS、LC-NMR大大提高了分离分析能力色谱—色谱联用技术GC-HPLC、GLC-GSC、HPLC-TLC模式识别与人工神经网络色谱专家系统：知识库、推理机、动态数据库等纸色谱第4页，共68页，2023年，2月20日，星期三仪器的发展五十年代第一台色谱仪问世第5页，共68页，2023年，2月20日，星期三六十年代就有数台5公斤重的色谱仪随阿波罗飞船同登月球，自动取样分析，1970年更有一台100克重的色谱仪飞上了火星。1967年时全世界共有色谱仪7万台1972年就发展到20万台现在我国的仪器就有数百万台过去庞大的体积，到现在的越来越小巧过去只有进口的，现在国产的也很好,比如说大连依利特公司第6页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱分析技术有广泛的应用领域色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。石油化工石油产品质量监控油田开发（吸附丝技术）第7页，共68页，2023年，2月20日，星期三医药卫生提纯净化—如手性色谱分离有效成分药物中间体的处理食品卫生监测（瘦肉精、农残、抗生素）化学研究样品提纯—如合成产品的检验等物质性质与其配比的相关性——色谱法和化学计量学方法结合第8页，共68页，2023年，2月20日，星期三生命科学研究DNA测序—用CE、HPLC技术、生物工程下游技术—细胞的培养、分离、纯化和分析检测

第9页，共68页，2023年，2月20日，星期三教材特点及参考书教材:新世纪全国高等中医药院校规划教材《分析化学》下册(供中药类专业)黄世德梁生旺主编参考书:(1)专著:付若农主编的《色谱技术丛书》化学工业出版社，涵盖所有色谱技术：色谱分析概论离子色谱方法及应用色谱定性和定量毛细管电泳技术及应用气相色谱检测方法色谱分析样品处理第10页，共68页，2023年，2月20日，星期三液相色谱检测方法色谱联用技术气相色谱方法及应用色谱柱技术高效液相色谱方法及应用色谱仪器维护与故障排除平面色谱方法及应用等等(2)杂志色谱科学杂志（J，ChromatographySci）1963年创刊,原名气相色谱杂志（J,GasChromat）,1969年改为现名,主要发表气相、液相原始论文和总结性文章（英文）和色谱标准图谱。色谱杂志（J，Chromatograpy）1958年创刊,系多科性（包括气相、液相色谱，薄层色谱，纸色谱，离子交换色谱等）国际杂志，刊登各种原始论文及讲座性文章，并附有定性、定量数据及色谱文摘，文章以英文、法文或德文发表，从1993年起分A、B卷发行，每年还有Review专辑。第11页，共68页，2023年，2月20日，星期三《色谱》，1984年创刊，刊登各种原始论文和综述，为双月刊。刊登色谱文章和评论性文章的还有各种分析化学相关的杂志，如各国的“分析化学”（中、美、英、日、德等），中文的《理化检验》、《环境化学》等专业文献上也有相当比例的色谱论文发表。（3）手册手册是最方便地查阅相关文献的工具，尽管所列数据并非最新的。如1999年3月起再版的《分析化学手册》第二版，共10个分册：1-基础知识与安全知识2-化学分析3-光谱分析4-电分析化学5-气相色谱分析6-液相色谱分析7-核磁共振波谱分析8-热分析9-质谱分析10-化学计量学第12页，共68页，2023年，2月20日，星期三（4）学术会议文集每年都有不同组织者组织召开的国际国内的各种分析界的学术报告会，会议的文集也是一种很好的参考文献，值得收集阅读。全国色谱学术报告会和浙江省色谱学术报告会均每两年举办一次，全国会议每次能征集到论文500篇以上，省会议也能征集到60篇以上。（5）色谱网站我们的工作与生活已经离不开网络,已有很多国际网站，包括美国化学会的网站，可搜索后查取相关文献。关于色谱方面的网站有：

第13页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱法的原理(两个相和一个装置)（1）两个相：固定相和流动相试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序从色谱柱中流出。

色谱柱第14页，共68页，2023年，2月20日，星期三其中的一相固定不动，称为固定相(stationaryphase)

；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相(mobilephase)

。（2）一个装置：柱子装有固定相的柱子称为色谱柱(chromatographiccolumn)GCGC填充柱HPLC填充柱C保护柱填料第15页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱法的分类（一）按两相的状态不同分类：按流动相的状态分为：(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）；(2)液相色谱：流动相为液体；(3)超临界色谱：流动相为超临界流体（常用CO2）；按固定相的不同：(1)气相色谱分为：气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）；(2)液相色谱分为：液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）；第16页，共68页，2023年，2月20日，星期三（二）按分离机理分类：1．吸附色谱法(absorptionchromatography)2．分配色谱法(partitionchromatography)3.离子交换色谱法(ionexchangechromatography)4.尺寸排阻色谱法(sizeexclusionchromatography)除以上四种外，还有亲和色谱法(affinitychromatography)，是利用不同组分与固定相(固定化分子)的高专属性亲和力进行分离的方法。

（三）按极性分类1.正相色谱法2.反相色谱法第17页，共68页，2023年，2月20日，星期三（四）按操作形式分类：1．柱色谱法（columnchromatography）：填充柱色谱和毛细管柱色谱；2．平面色谱法((planechromatography)：（1）纸色谱法(paperchromatography)（2）薄层色谱法(thinlayerchromatography)（3）薄膜色谱法(thinfilmchromatography)

第18页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱法的分类气—液色谱法（GLC）填充柱色谱法气—固色谱法（GSC）气相色谱法涂壁毛细管柱（WCOT）（GC）毛细管柱色谱法多孔层毛细管柱（PLOT）普通柱色谱法液-液色谱法（LLC）柱色谱法液-固色谱法（LSC）高效液相色谱法离子交换色谱法(IEC)液相色谱法尺寸排阻色谱法(SEC)（LC）纸色谱法（PC）平面色谱薄膜色谱法(TFC)

薄层色谱法（TLC）超临界流体色谱法（SFC）第19页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱法的特点（1）分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广

气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。

液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。

第20页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱法不足之处：因为定性需要已知物质，被分离组分的未知物质定性较为困难，需要借助MS，NMR，IR等手段。A：样品；B：对照品1；C：对照品2第21页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱分离过程色谱分离过程是在色谱柱内完成的。以气相色谱为例。气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的分离机理不同(一)气固(液固)色谱的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气固色谱的分离机理:吸附与脱附的不断重复过程；(二)气液(液液)色谱的固定相:由担体和固定液所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。气液色谱的分离机理：溶解与挥发的反复多次分配过程。第22页，共68页，2023年，2月20日，星期三例:气相色谱分离过程当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行；较难被吸附（溶解）的组分随载气较快地向前移动，较易被吸附（溶解）的组分则随载气较慢地移动。经过一定时间后，各组分就彼此分离。第23页，共68页，2023年，2月20日，星期三基本过程：相平衡-相转移①平衡观点仪器：色谱柱+检测器②动力学观点各组分分配系数不等，产生差速迁移第二节色谱流出曲线与术语第24页，共68页，2023年，2月20日，星期三第二节色谱流出曲线与术语一.色谱流出曲线图色谱流出曲线：由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线。色谱峰：当某组分从色谱柱流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线称为该组分的色谱峰。第25页，共68页，2023年，2月20日，星期三二.基线(Baseline)

无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。三.峰高(h)

色谱峰顶到基线的垂直距离,上图BA段。色谱流出曲线和色谱峰基线（a）;峰高（h）信号进样空气峰色谱峰ha第26页，共68页，2023年，2月20日，星期三四.色谱峰区域宽度

(w)(衡量柱效)

是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半，上图EF段；（2）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度W1/2=2.354，上图GH段；（3）峰底宽(W)：即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。W=4，上图IJ段。)W1/21/2h第27页，共68页，2023年，2月20日，星期三

五、拖尾因子（tailingfactor）用于衡量色谱峰的对称性。不正常色谱峰：拖尾峰、前延峰T=0.95-1.05，对称峰T<0.95，前延峰T>1.05，拖尾峰第28页，共68页，2023年，2月20日，星期三六.保留值（一）保留时间

1.死时间tM：不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。

信号进样tM第29页，共68页，2023年，2月20日，星期三死时间的测定很难：

无合适样品（完全不保留并有足够强的紫外信号）一般测定方法为（紫外检测器）：1.正向-四氟乙烯;反向-苯甲酸、硝酸等。2.比流动相少一个C的同系物3.不具备条件时可用下式计算：

第30页，共68页，2023年，2月20日，星期三2.保留时间tR组分从进样到在柱后出现峰极大点所需的时间，称为保留时间，如图19-1中O′B。3.调整保留时间tR′

tR′=tR－tM

（二）保留体积1.死体积VM

VM=tM×

FC

2.保留体积VR

VR=tR×

FC

3.调整保留体积VR′

VR′=VR－VM=tR′×

FC

第31页，共68页，2023年，2月20日，星期三（三）相对保留值ri，s

r2，1=t´R2

/t´R1=V´R2/V´R1

相对保留值是衡量分离情况的重要参数，大多数手册上可查到。因其只与色谱柱种类及柱温有关，故也是重要的定性指标。七.分配系数和容量因子

（1）分配系数(K)：在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值

第32页，共68页，2023年，2月20日，星期三（2）容量因子（k）

在一定温度和压力下，两相平衡时，组分在两相中的质量比。

k

第33页，共68页，2023年，2月20日，星期三使A、B两组分完全分离的前提：第一，两组分的分配系数必须有差异；第二，足够长的色谱柱。(3)相平衡常数与保留时间的关系第34页，共68页，2023年，2月20日，星期三八.分离度（resolution,反映柱效）R≤1，两峰有部分重叠R=1.5，分离程度可达99.7%R=2，完全分离《中国药典》规定：R>1.5，相邻两组分分离第35页，共68页，2023年，2月20日，星期三九.等温线分类：直线型凸型凹型溶液浓度影响等温线形状CsCm第36页，共68页，2023年，2月20日，星期三例：用一根固定相的体积为0.148mL，流动相的体积为1.26mL的色谱柱分离A,B两个组分，它们的保留时间分别为14.4min，15.4min，不被保留组分的保留时间为4.2min，试计算：

（1）各组分的容量因子

（2）各组分的分配系数

（3）AB两组分的选择因子rB,A解：（1）kA=(14.4min-4.2min)/4.2min=2.43

kB=(15.4min-4.2min)/4.2min=2.67K=kβ=kVm/VsKA=kAVm/Vs=2.43×1.26mL/0.148mL=20.7KB=kBVm/Vs=2.67×1.26mL/0.148mL=22.7(3)rB,A=KB/KA=22.7/20.7=1.10第37页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱流出曲线的意义由色谱流出曲线可以实现以下目的：（1）根据色谱峰的数目，可以判断试样中所含组分的最少个数。（2）根据色谱峰的保留值进行定性分析。（3）依据色谱峰的面积或峰高进行定量分析。（4）依据色谱峰的保留值以及峰宽评价色谱柱的分离效能。第38页，共68页，2023年，2月20日，星期三第三节色谱法基本理论色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定相的结构和性质,如分配系数）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论第39页，共68页，2023年，2月20日，星期三（一）塔板理论-柱分离效能指标1.塔板理论（platetheory）

半经验理论：将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；在每一个塔板上，被分离组分达到一次分配平衡。塔板理论的假设：(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；这一小段间隔的柱长称为理论塔板高度。(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)

每次分配的分配系数相同。第40页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离（理论塔板高度）：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!第41页，共68页，2023年，2月20日，星期三2.有效塔板数和有效塔板高度组分在t0时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：第42页，共68页，2023年，2月20日，星期三示例例：用一根柱长为1m的色谱柱分离含有A，B，C，D四个组分的混合物，它们的保留时间tR分别为6.4min,14.4min,15.4min,20.7min,其峰底宽Wb分别为0.45min,1.07min,1.16min,1.45min。

试计算：各谱峰的理论塔板数。解：第43页，共68页，2023年，2月20日，星期三3.塔板理论的特点和不足(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n

越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，即使分配系数只有微小的差别，仍可获得好的分离效果。所得色谱峰越窄。(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效（如塔板高度H）的因素及提高柱效的途径。第44页，共68页，2023年，2月20日，星期三（二）速率理论-影响柱效的因素

1956年荷兰学者范弟姆特（VanDeemter)等提出了色谱过程的动力学理论，他们吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系。1.速率方程（也称范.弟姆特方程式）

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度;u：载气的线速度(cm/s)

减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；

A、B、C三项常数各与哪些因素有关？第45页，共68页，2023年，2月20日，星期三A─涡流扩散项第46页，共68页，2023年，2月20日，星期三A─涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管柱，A项为零。第47页，共68页，2023年，2月20日，星期三B/u—分子扩散项第48页，共68页，2023年，2月20日，星期三B/u—分子扩散项

B=2γDgγ：弯曲因子，空心毛细管,γ=1；填充柱色谱,γ

<1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(4)扩散系数Dg与组分及载气的性质有关：

Dg

∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。Dg∝（M组分）-1(5)扩散系数Dg随柱温升高而增加。第49页，共68页，2023年，2月20日，星期三C·u—传质阻力项第50页，共68页，2023年，2月20日，星期三C·u—传质阻力项

传质阻力系数包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL系数即：C=（Cg+CL）k为容量因子；Dg、DL为扩散系数。减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。第51页，共68页，2023年，2月20日，星期三2.载气流速与柱效——最佳流速载气流速高时：

传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：

分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。H-u曲线与最佳流速：

由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有零值点。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。第52页，共68页，2023年，2月20日，星期三最佳流速uopt与最小理论塔板高度Hmin第53页，共68页，2023年，2月20日，星期三3.速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展，柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。第54页，共68页，2023年，2月20日，星期三3.速率理论的要点(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。第55页，共68页，2023年，2月20日，星期三（三）分离度

塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素；

区域宽度──色谱过程的动力学因素。

第56页，共68页，2023年，2月20日，星期三色谱分离中的四种情况的讨论：①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，△K较大,但分离的不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。第57页，共68页，2023年，2月20日，星期三分离度的表达式：定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和一半的比值。R=0.8：两峰的分离程度可达89%，有部分重叠；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。第58页，共68页，2023年，2月20日，星期三（四）色谱分离方程式1.选择因子：第59页，共68页，2023年，2月20日，星期三令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻