鱼腥草地上茎粗提物的抑菌活性研究

19鱼腥草地上茎粗提物的抑菌活性研究摘要鱼腥草为三白草科（Saururaceae）蕺菜多年生草本植物，在我国多分布于中部、东南及西南部各省。鱼腥草内含挥发油、黄酮、蛋白质、维生素等多种化学成分。目前对鱼腥草的抑菌活性研究多是全株研究。因此，为了更进一步考查鱼腥草茎各部分的抑菌活性，本试验主要对鱼腥草的地上茎的抑菌活性进行试验研究。本研究以鱼腥草地上茎为原料，用95%乙醇进行粗提得到乙醇浸膏，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇为溶剂对乙醇浸膏的水悬浮液进行萃取，依次得到四种粗提物，即石油醚粗提物、乙酸乙酯粗提物、正丁醇粗提物和水液粗提物。采用滤纸片法测定了四种粗提物分别对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌、黑曲霉四种菌种的抑菌活性。结果表明，鱼腥草地上茎粗提物对四种菌种均有不同程度的抑制作用。关键词鱼腥草，粗提物，抑菌活性，最低抑菌浓度，滤纸片法ABSTRACTHouttuyniacordataisperennialherbsofSaururaceaeandisextencivelycultivatedincentral,southwestandsoutheastprovincesofChina.Therearealotofchemicalconstituentsinthehouttuyniacordata,includingvolatileoils,flavonoids,protein,vitaminandsoon.Atpresent,theantibacterialactivityofHouttuyniacordatawasstudyedinwhole-plantway.Inordertobetterunderstandantibacterialactivityindifferentpartsofthestem,theinhibitoryexperimentofcrudeextractofhouttuyniastemsonthegroundwerestudiedinthispaper.Ethanolextractivewasextractedwith95%ethanolfromhouttuyniacordatapowder.Thentheextractivewasdissolvedinthewater.Accordingtothepolarityoforganicsolvent,foursolutionthatispetroleumether,ethylacetate,n-butylalcoholextractedinthewatersolutioninturn.Thatarepetroleumetherextractive,ethylacetateextractive,butanolextractiveandwater-liquidextractive.Filterpapermethodwasapplied,whichdeterminedtherejectioncapabilityoffourextractivetoStaphylococlusaureus,E.coli,Microzyme,Aspergillusnigerrespectively.Theresultsshowedthatcrudeextractofhouttuyniastemsonthegroundhadthevariousdegreeinhibitoryactivitytofourstrains.KeywordsHouttuyniacordata，crudeextract，inhibitoryactivity，anticrobialminimumdosage，filterpapermethod目录摘要 ⅠABSTRACT Ⅱ1绪论 11.1课题背景 11.1.1鱼腥草的生物学特性 11.1.2中国的鱼腥草资源分布情况 11.2鱼腥草的研究现状及开发应用概况 11.2.1鱼腥草的化学成分研究概况 11.2.2鱼腥草在临床中的应用概况 21.2.3鱼腥草在食品工业中的应用概况 31.2.4鱼腥草在其它领域中的应用概况 41.3鱼腥草的药用价值研究概况 51.3.1抗菌作用 51.3.2抗病毒作用 51.3.3增强机体免疫功能 51.3.4抗炎镇痛作用 51.3.5抗过敏作用 61.3.6其它 61.3.7毒副作用 61.4鱼腥草的抑菌活性研究概况 61.5立题的目的和意义 72材料与方法 92.1试验材料及仪器 92.1.1试验样品 92.1.2试验试剂 92.1.3试验仪器 92.2试验内容与方法 92.2.1鱼腥草粗提物的制备 92.2.2培养基的制备 102.2.3滤纸片的制备 102.2.4菌悬液的制备 102.2.5抑菌试验方法 112.2.6最小抑菌浓度(MIC)的测定 113结果与分析 123.1鱼腥草地上茎粗提物抑菌试验结果 123.2最小抑菌浓度的试验结果 123.2.1石油醚萃取相最小抑菌浓度的试验结果 123.2.2乙酸乙酯萃取相最小抑菌浓度的试验结果 133.2.3正丁醇萃取相最小抑菌浓度的试验结果 133.2.4水样提取物溶液的最小抑菌浓度的试验结果 144讨论 154.1鱼腥草地上茎抑菌活性成分提取方法的探讨 154.2鱼腥草地上茎粗提物抑菌活性测定方法的探讨 15结论 16参考文献 17致谢 191绪论1.1课题背景1.1.1鱼腥草的生物学特性鱼腥草(HouttuyniaCordataThunb)又名蕺菜、蕺儿根、摘儿根等，为三白草科(Saururaceae)蕺菜多年生草本植物，因其茎叶搓碎后有鱼腥味，故名鱼腥草。鱼腥草植株矮小，高30～50厘米，茎下部匍匐或作地下根状茎生于浅层土壤中，白色，节上轮生小根；茎上部直立，叶心形或宽卵形，常见绿色，偶有紫色；花期5～6月，果期10～11月。叶互生，薄纸质，有腺点，背面尤甚，卵形或阔卵形，长4～10厘米，宽2.5～6厘米，基部心形，全缘，背面常紫红色；掌状叶脉5～7条；叶柄长1～3.5厘米，无毛；托叶膜质长1～2.5厘米，下部与叶柄合生成鞘。花小，夏季开，无花被，排成与叶对生、长约2厘米的穗状花序；总苞片4片，生于总花梗之顶，白色，花瓣状，长1～2厘米；雄蕊3枚，花丝长，下部与子房合生；雌蕊由3个合生心皮所组成。蒴果近球形，直径21.1.2中国的鱼腥草资源分布情况三白草科共4属8种，分布于亚洲和北美，中国产3属4种，蕺菜属仅1种，即鱼腥草。鱼腥草多分布于我国中部、东南及西南部各省，尤以云南、广东、广西、四川、湖北、湖南、浙江、江苏、福建等省居多，河南、甘肃、陕西、山东等省也产。鱼腥草喜湿，多生于湿地、山谷潮湿处，常生长在背阴山坡、村边田埂、河畔溪边及湿地草丛中，且耐阴、耐瘠薄，对环境要求不严格，对温度要求也不严，零下15℃能越冬，12℃就能出苗，15～301.2鱼腥草的研究现状及开发应用概况1.2鱼腥草是药食一体植物，含有丰富的营养成分，每100g干品中含蛋白质5．26g、脂肪2.41g、碳水化合物67.5g。据研究测定，鱼腥草含粗蛋白质2%、粗脂肪0.4%、多糖类6%、钙0.07%、磷0.053%、铁和鱼腥草素、癸醛、挥发油（月桂油烯）0.12%-0.05%及蕺菜碱等。此外还含有维生素C、维生素B、维生素E和多种氨基酸[1]。鱼腥草主要含有挥发油和黄酮类化合物。其药用成分主要为挥发油，挥发油的主要成分包括鱼腥草素(癸酰乙醛)、月桂烯、月桂醛、癸醛、癸酸和甲基正壬基酮等。黄酮类化合物主要包括鱼腥草花、叶和果中均含有的槲皮素、槲皮甙、异槲皮甙、芸香甙、金丝桃甙、阿芙甙和芦丁等，也可作为药用成分。另外，药用成分还包括d-柠檬烯、α-蒎烯、莰烯、丁香烯、芳樟醇、乙酸龙脑酯、绿原酸、棕榈酸、亚油酸、油酸和硬脂酸等。除此之外，鱼腥草还含有其它如绿原酸、棕搁酸、亚油酸、硬脂酸)等有机酸及脂肪酸；谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等十几种氨基酸；豆幽醇、菜豆醇、谷醇等当醇，还含有毗咙类和阿朴啡类生物碱等化合物。1.2.2鱼腥草以其显著的药理作用而被广泛地应用于临床。(1)呼吸系统疾病①肺炎疾病李冰昱等[2]报道，对35例老年人肺炎患者采用医常规治疗基础上加用鱼腥草注射液静脉滴注治疗后总有效为94.3%，显著高于对照组仅采用西医常规治疗的83.3%。王霞报道，对156名患儿随机分组，治疗组给予新鱼腥草素钠注射液配伍抗生素治疗，对照组采用病毒唑配伍抗生素治疗。两组疗效经统计学处理差异有显著性，治疗组疗效优于对照组。②急性上呼吸道感染疾病李朝友[3]报道，将93例上呼吸道感染病例随机分为治疗组和对照组，治疗组在其他相同治疗的基础上加用新鱼腥草素钠注射液，治疗组总有效率96%，对照组总有效率87%，治疗组疗效明显优于对照组。李京鹤等报道，对196例急性上呼吸道感染病例随机分成治疗组和对照组，分别以鱼腥草与病毒唑治疗，结果治疗组疗效优于对照组。③其他疾病胡静等[4]报道，128例毛细支气管炎患儿采取在西医常规对症治疗的基础上，加用新鱼腥草素钠注射液静脉滴注效果满意。孔微[5]报道，用中成药蒲丁合剂口服，联合鱼腥草注射液雾化吸人治疗急性咽炎198例，并与口服抗生素104例作对照，治疗组痊愈182例(91.9%)，好转13例(6.5%)；对照组痊愈4例(3.8%)，好转82例(78.8%)。两组治愈率和总有效率比较差异均有非常显著性意义。裴志强等[6]报道，对60例流行性腮腺炎无合并症患者随机分为两组，均给予青霉素、病毒唑静脉滴注，金黄散外敷，治疗组在此基础上加用新鱼腥草素钠注射液。治疗组显效23例，有效5例，无效2例，总有效率92.33%，明显优于对照组。(2)消化系统疾病牛庆婷等[7]报道，对于儿科发生在秋冬流行的小儿急性腹泻，口服思密达的同时配合静脉滴注鱼腥草注射液，疗效明显优于单纯思密达口服治疗的对照组。(3)泌尿系统疾病姜明全等[8]报道，将60位肾盂肾炎患者随机分为两组，均用左氧氟沙星针0.2g稀释于5%葡萄糖或0.9%氯化钠液250ml中，静脉滴注，2次／d。治疗组在此基础上加用鱼腥草注射液，有效地提高了治愈率，减少了疾病的复发。(4)妇科疾病张凤秀等[9]报道，对206例女性不孕症采用彩色多普勒超声实时监测下用鱼腥草注射液行子宫输卵管通液检查，发现超声能清晰地观察子宫输卵管通液程度，使不孕症的诊断显示更直观，且不适症状少，其诊断率、确诊率明显提高。(5)五官科疾病罗荣帮等[10]报道，对113例(118只眼)单纯疱疹性角膜炎患者采用随机分组方法分为治疗组及对照组。治疗组57例(60只眼)用鱼腥草注射液静脉滴注、点眼及贝复舒点眼；对照组56例(58只眼)用无环鸟苷注射液静脉滴注联合局部点眼。治疗组痊愈率为86.67%，有效率为93.33%，与对照组痊愈率(51.72%)和有效率(68.97%)比较，差异有显著性(P<0.05)。随访病例治疗组52只眼，复发2只眼，复发率为3．85%；对照组30只眼，复发10只眼，复发率为33.33%。两组比较，差异有显著性(P<0.05)。(6)肿瘤性疾病赵小青等[11]报道，随机择取原发肺癌Ⅲb以后者48例，分为对照1组、对照2组和观察组。对照1组予西药小牛胸腺肽，对照2组予小牛胸腺肽加服十全大补汤。观察组给予鱼腥草注射同时口服十全大补汤加减。对照1组(16例)2年总生存率12%；对照2组(16例)2年总有效率25%；观察组(16例)2年总有效率37.5%。(7)其他疾病查丽[12]报道，采用新鱼腥草素钠注射液联合参麦注射液治疗1例急性病毒性心肌炎并心源性休克患者，收效较佳。于红芳报道，将患者76例肺性脑病患者随机分为两组，两组均予西医常规治疗，治疗组另予醒脑静及鱼腥草注射液静脉滴注。结果治疗组疗效优于对照组。1.2.3鱼腥草除了作为我国的一种传统药用植物在临床上广为使用外，在民间还被当作具有特殊风味和丰富营养价值的，能祛病强身和美容的，无污染、纯天然的野菜加以食用。我国民间一向有用鱼腥草作为菜而食用的习惯，可作凉拌菜，或用来炖肉、调面和煮粥等。随着对鱼腥草药理作用和保健功效的深入研究，其保健产品的开发研制日益受到广大科学工作者的重视。现已开发出多种以鱼腥草为主要原料的保健食品，如鱼腥草茶、鱼腥草饮料、鱼腥草营养液、鱼腥草袋装方便食品和鱼腥草蜜酒等许多新产品。除此之外，鱼腥草还可添加在面粉中，制成鱼腥草面包、蛋糕和面条等。在夏季，鱼腥草经榨汁或浸提处理后制成的鱼腥草饮料、鱼腥草可溶性纤维饮料或鱼腥草汽水，具有清热解暑、减肥等功能，福建省已经有两大公司生产鱼腥草饮料，其口感佳、又解渴、饮用方便，受到广大消费者的欢迎。鱼腥草饮料要解决鱼腥味较重的难题，可以通过添加南瓜粉、刺梨汁、绞股蓝碎末调整和改善鱼腥味，同时提高饮料的营养价值。每生产50kg鱼腥草汽水需鲜鱼腥草2.5kg。吴天祥等人以鱼腥草、南瓜、刺梨为原料，通过酒精发酵和醋酸发酵制成天然的营养保健饮料[13]。鱼腥草的根茎经切分、炒青、整形等制茶工艺，可制成香喷喷的粉末状的散装或袋泡鱼腥茶原料，进一步调配、精制成商品茶，具有减肥保健作用。福建农林大学研制的鱼腥草袋泡茶已在市面上广泛销售。每生产50kg鱼腥草茶需鲜鱼腥草茎叶500kg。陈根洪等人将洗净的新鲜鱼腥草放入质量分数为0.1%的柠檬酸溶液中，在温度100℃下烫漂1min，然后在质量分数为0.1%的NaHSO4溶液中护色处理30min，经漂洗后在温度70℃下真空恒温干燥在日本，鱼腥草和蜂蜜等经发酵后制成一种集多种保健功效的鱼腥草酒，该保健酒对便秘、低血压、高血压、机体疲劳、鼻窦炎、湿疹等几十种疾病有广泛的疗效，广受日本人民的青睐。鱼腥草酒对癌症患者在接受放射性治疗中所引起的不良反应有缓解和治疗作用。每生产50kg鱼腥草酒需鲜鱼腥草lOkg。鱼腥草食品的开发，正从传统的半成品(凉拌、干品)及饮料、酒、茶等轻工食品向航空食品、减肥食品和戒烟食品等方向发展[14]。1.2.4鱼腥草既可作为饲料，也可作为兽药。鱼腥草作为猪饲料可用鲜品单喂，也可煮熟后和其它饲料合喂，具有健脾理肺、促进生长的作用。在兽医临床上，各种处方与习惯用法很多，鱼腥草用于牛肺炎发热、牛肺痈、猪肺炎咳嗽、猪风热感冒、猪喘气病的治疗，效果非常理想[15]。当前，食品安全问题已成为世界人民共同关心的大事，为了人体的健康和避免餐桌污染，养殖业中许多疾病的治疗都采用了中药。多种鱼类的急、慢性肠炎及鳖的腮腺炎、红脖子病、白底板病和虾的多种细菌性和病毒性疾病等都选用含有鱼腥草的中药配方，以鱼腥草为主的方剂已成为这些常见病和多发病的常规治疗。1.3鱼腥草的药用价值研究概况1.3.1抗菌作用鱼腥草鲜汁对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，对强毒人型结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等有明显抑制作用。鱼腥草的有效成分癸酞乙醛，其对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、革兰阳性肺炎球菌、乙型溶血性链球菌、芽抱杆菌等均有一定抑制作用，对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌作用较强[16]。合成的癸酞乙醛亚硫酸加成物不仅性质稳定，并保留了癸酞乙醛的抗菌活性，且具有类似的特殊香味，其对多种革兰氏阳性及阴性细菌均有明显抑制作用，以金黄色葡萄球菌及其耐青霉素菌株、肺炎双球菌、流感杆菌为敏感，卡他球菌、伤寒杆菌次之，大肠杆菌、痢疾杆菌等则不敏感。合成鱼腥草素并能明显延长感染结核菌的小鼠的生存时间。新鱼腥草素(合成的十二酞乙醛)也有明显的抗菌活性口鱼腥草注射液还对痢疾杆菌和绿脓杆菌等有抑制作用。但也有报道认为，鱼腥草注射液中癸酞乙醛含量甚微，体外及小鼠体内并无抗菌活性。1.3.2抗病毒作用鱼腥草煎剂在体外对京科68-1株病毒有抑制作用，并能延缓孤儿病毒的致细胞病变作用[17]。郑宣鹤等，研究证明鱼腥草对出血热病毒(EHFV)也有一定抑制作用。朱宇同等研究发现其非挥发油部分腹腔注射对流感病毒FN4：试验感染小鼠有明显预防保护作用，经口或滴鼻给药也有一定效果，挥发油部分无效。1.3.3增强机体免疫功能任玉翠等[18]用X射线照射每只口服鱼腥草营养液0.4ml/d的小鼠及对照1个月后发现，试验小鼠血清溶血素含量、巨噬细胞吞噬百分率指数明显高于对照组。鱼腥草能够显著提高外周T淋巴细胞的比例，增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，促进绵羊红细胞免疫所致的Igm的生成，从而可以提高机体的特异性免疫能力雾化吸入鱼腥草提取液，可使试验鼠肺泡巨噬细胞吞噬率、肺泡冲洗液和外周血中ANAE阳性细胞的比例显著提高，而外周血白细胞移植性指数明显降低。1.3.4抗炎镇痛作用鱼腥草煎剂对大鼠甲醛性脚肿有较显著的抑制作用，对于人x-球蛋白在Cu2+存在下的热变性，也有显著抑制作用。鱼腥草素具有一定的抗炎活性，能显著抑制巴豆油、二甲苯所致小鼠耳肿胀，对HAc所致腹腔毛细血管通透性增高也有显著抑制作用。用其灌胃给药还可以抑制醋酸所致的小鼠扭体反应，延长镇痛反应潜伏期，拮抗甲醛致痛作用[19]。1.3.5抗过敏作用鱼腥草挥发油能明显拮抗SRS-A对豚鼠离体回肠和肺条的作用，静脉注射l00mg/kg能拮抗SRS-A增加豚鼠肺溢流的作用，并能明显抑制致敏豚鼠离体回肠的过敏性收缩及拮抗组织胺、乙酞胆碱所致豚鼠离体回肠收缩；对于豚鼠离体气管平滑肌，具有直接的舒张作用[20]。1.3.6其它鱼腥草因含有大量的钾盐及槲皮素而具有利尿作用，腹腔注射鱼腥草对氨雾刺激所致小鼠咳嗽具有一定抑制效果。此外，鱼腥草皮下注射，还有轻度镇静、抗惊作用。其所含槲皮素还有较好的祛痰、止咳、降血脂、扩张冠脉等作用。鱼腥草还具有一定的抗癌作用，鱼腥草素和新鱼腥草素对小鼠艾氏腹水癌也有明显的抑制作用。合成鱼腥草素还能提高小鼠单核一巨噬细胞的吞噬活性，对小鼠移植性肝癌也有一定抑制效果[21]。1.3.7毒副作用鱼腥草毒性很小，尚未见中毒报告。合成鱼腥草素给小鼠灌服。为(1.6土0.081)g/kg，静脉注射每日75～90mg/kg，约相当于人用量的200倍，连续7日，未致死。犬静脉滴注38或47mg/kg不引起死亡，但达到61-64mg/kg时，可引起肺脏严重出血而死亡[22]。人每日口服80--160mg/kg，连服30日，也未见明显毒性反应。1.4鱼腥草的抑菌活性研究概况史蕙等[23]研究表明鱼腥草油对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，但对肺炎球菌、乙型溶血性链球菌有一定抑制作用。有效成分鱼腥草素在体外试验对卡他球菌、流感杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，对痢疾杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌则较差。亦有报告，鱼腥草与桔梗的合剂，对肺炎球菌无抗菌作用(试管法，平板法)。鱼腥草能延缓小鼠试验性结核病变的发展，延长小鼠寿命。从鱼腥草中提出-种油状物，对许多微生物生长都有抑制作用，特别对酵母和霉菌。熊大胜等[24]用鱼腥草提取物对几种常见微生物进行了抑菌试验，结果表明，其对微生物的繁殖生长有明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、青霉菌、黑曲霉菌及酵母菌的最低抑菌浓度分别为0.25%，1.0%，2.0%，8%，8%，8%。研究证明，鱼腥草有一定的抗菌作用因其所含的鱼腥草素、月桂醛等挥发油成分，对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、痢疾杆菌等均有一定抑制作用，对金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌作用较强。试验表明，鱼腥草鲜汁对金黄色葡萄球菌有显著抑制作用，加热后作用会有所减低。张俭等[25]研究发现鱼腥草地上部分挥发油含量明显低于地下部分，鲜样表现十分明显。在贮藏过程中地上部分和地下部分的挥发油含量均减少。贮藏过程中挥发油含量的变化与其抑菌试验结果相当吻合。鱼腥草挥发性油溶液对金黄色葡萄球菌和八叠球菌具有较强的抑制作用，地下部分抑菌效果强于地上部分。但鱼腥草在贮藏过程中挥发油的抑菌效果是变化的，表现为鲜样有最强的抑菌作用，最低抑菌浓度为1/2×10-3mg/ml，贮藏12个月后最低抑菌浓度变为2×10-3mg/ml，抑菌效果逐渐减弱。因此，若用鱼腥草大批量生产药用制剂或保健药品应该尽量用鲜草而不用干草。徐燕[26]研究了鱼腥草中天然防腐剂的提取方法和抑菌作用，结果表明，用食用乙醇提取鱼腥草中防腐物质的最佳提取工艺参数为：固液比1：15，提取温度80℃，提取时间为10h。鱼腥草醇提取物对试验用常见食品污染菌有较强的抑制作用，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为6.25mg/mL，对金黄色葡萄球菌为12.5mg/mL，对汉逊氏酵母菌为25mg/mL，对黑曲霉及青霉等均为50mg/mL，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性pH范围均为4～7，对汉逊氏酵母菌为4～6罗增桂，钟晓丽等[27]研究发现鱼腥草挥发性油溶液对金黄色葡萄球菌和八叠球菌有较强抑菌作用，但鱼腥草在干燥过程中的抑菌效果也是不同的。干燥0d和0.5d样品的挥发性油对金黄色葡萄球菌和八叠球菌的MIC都为5×10-4mg/mL，干燥8d后MIC变为10-3mg/mL。干燥16d后为2×10-3mg/mL，抑菌效果呈现降低趋势。总的来说，鱼腥草在干燥过程中随着水分减少，化学营养成分普遍降低。营养成分减少，抑菌效果降低，两者之间存在关联性。因此，用于生产鱼腥草医药及保健产品所使用的原料鱼腥草不宜久储，尽量不用干草，最好使用鲜样。谭宝秀[28]采用正交试验方法，研究确定鱼腥草挥发油浸提的最佳工艺条件为：物料比1：10、浸提温度85℃、pH值7～8、浸提时间8h，提取液最大吸收波长为450nm。抑菌试验表明，鱼腥草挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌均有一定的抑制作用，最低抑菌浓度分别为0.6%、0.8%、0.6%1.5立题的目的和意义鱼腥草以其广泛的药理作用而受到人们的重视，并且鱼腥草具有很高的营养保健作用，符合现代人对饮食的需求。我国鱼腥草资源丰富，充分利用鱼腥草开发药品、营养保健食品等，将有着较高的开发价值与非常广阔的市场前景。鱼腥草抗菌和抗病毒功效持久，使用安全，开发前景十分乐观；同时，鱼腥草营养丰富，是一种极具开发价值、越来越受到人们关注的药食两用植物，已被国家卫生部正式确定为“既是药品，又是食品”的极具开发潜力的资源之一。目前，鱼腥草抑菌活性成分的提取，尚无统一的方法，并且鱼腥草叶、地上茎、地下茎的抑菌作用有一定的差别。本研究主要是探讨鱼腥草地上茎的抑菌作用，选用几种常见的生活污染菌为供试菌种，在鱼腥草地上茎用于食品防腐保藏等天然防腐剂研究及开发植物性杀菌剂等方面的综合开发提供科学依据。以期对更有效开发和利用鱼腥草地上茎这一丰富的药用植物自然资源能够起到一定的指导作用。2材料与方法2.1试验材料及仪器2.1.1试验样品新鲜鱼腥草地上茎6kg（均购于攀枝花市九附六菜市场），将其全部洗净并切成小段，在60℃下2.1.2试验试剂（1）试剂95%乙醇，石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，所用试剂均为分析纯。（2）供试菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)大肠杆菌(Escherichiacoli)黑曲霉(Aspergillusniger)酵母菌(Saccaromycescerevisiae)上述菌种均由攀枝花学院生物与化学工程学院生物试验室提供。（3）培养基成分蛋白胨，牛肉膏，NaCl，琼脂，马铃薯，葡萄糖，无菌生理盐水。2.1.3试验仪器RE52型旋转蒸发器(巩义市予华仪器有限公司)DH-500AB型电热恒温培养箱(北京中兴伟业仪器有限公司)SW-CJ-1Cμ型双人单面净化工作台(北京永光明医疗仪器有限公司)YX280B型高压蒸汽灭菌器(北京中兴伟业仪器有限公司)AEG-220型电子分析天平（上海恒丰科学仪器有限公司）2.2试验内容与方法2.2.1鱼腥草粗取物的制备（1）鱼腥草粗提物的制备流程，见图2.1。（2）鱼腥草粗提物的制备方法取干样6kg，用95%乙醇进行浸提后过滤，滤液（重复提取五次后，滤液合并）用旋转蒸发仪浓缩回收溶剂得到乙醇浸膏，将其用蒸馏水充分悬浮。得到的溶液依次经过石油醚试剂、乙酸乙酯试剂、正丁醇试剂的萃取，各萃取液及最后的水相萃余液用旋转蒸发仪浓缩，回收溶剂后得到四种的粗提物，即：石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物、水相萃取物。新鲜鱼腥草地上茎60℃粉末95%乙醇浸提乙醇提取液回收溶剂浸膏用蒸馏水悬浮水悬浮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取石油醚萃取相乙酸乙酯萃取相正丁醇萃取相水溶液萃余相回收回收回收回收溶剂溶剂溶剂溶剂石油醚相粗提物乙酸乙酯相粗提物正丁醇相粗提物水溶液相粗提物图2.1鱼腥草粗提物的制备流程2.2.2培养基的制备(1)细菌培养基的制备[29]：按表2.2中各种材料的量分别称取后，混合于水中，加热煮沸至琼脂完全溶解，用10%氢氧化钠溶液或10%盐酸液调节pH至7.6左右，趁热分装于三角瓶中，塞好棉塞，捆扎好，在0.1MPa，121℃下20min(2)霉菌培养基的制备[30]：马铃薯-蔗糖琼脂培养基的配料见表2.3，将去皮的马铃薯切成lcm见方的小块，称取200g加l000mL自来水煮沸20min，用四层纱布过滤，取滤液并加水补足1000mL，加入葡萄糖和琼脂加热搅拌至琼脂完全溶解。趁热分装于三角瓶中，塞好棉塞，捆扎好，在0.1MPa，121℃下20min高压蒸汽灭菌备用。2.2.3选用102型新华滤纸，经打孔器制成直径为6mm的圆纸片，分装于洁净干燥的培养皿内（50张／皿）进行干热灭菌后备用。2.2.4菌悬液的制备将所需的供试菌种，用接种环轻轻刮取一环，置适量生理盐水中，用涡旋混合一分钟，使菌均匀分散其中。表2.2牛肉膏-蛋白胨琼脂培养基成分蛋白胨牛肉膏NaCl琼脂水PH值含量10.0g3.0g5.0g20.0g1000mL7.6表2.3马铃薯-葡萄糖琼脂培养基成分马铃薯葡萄糖琼脂水PH值含量200.0g20.0g20.0g1000mL自然2.2.5抑菌试验方法分别将鱼腥草四种粗提物用无菌水倍比稀释成0.1g／mL的溶液，将滤纸制成直径为6mm的滤纸圆片，经过灭菌后，浸渍各个溶液中24h，然后干燥备用。配制上述菌种分别所需的培养基，经灭菌后倒入培养皿中冷却。用无菌移液管向培养皿平板中分别加入0.3mL菌悬液，用L型玻棒涂布均匀，将已制备好的含有鱼腥草提取物溶液的滤纸片放入含菌平皿上，每皿贴3片（其中一片为无菌水空白做对照试验），每菌两组培养皿，做4次重复。细菌在37℃条件下恒温培养24h，真菌在28℃条件下恒温培养2.2.6最小抑菌浓度(MIC)的测定分别将鱼腥草四种粗提物用无菌水倍比稀释成0.1g／mL、0.08g／mL、0.06g／mL、0.04g／mL、0.02g／mL、0.01g／mL系列浓度溶液，将经过灭菌的直径为6mm的滤纸圆片浸渍各个系列24h，然后干燥备用。配制上述菌种分别所需的培养基，经灭菌后倒入培养皿中冷却。用无菌移液管向培养皿平板中分别加入0.3mL菌悬液，用L型玻棒涂布均匀，将已制备好的含有鱼腥草提取物溶液的滤纸片放人含菌平皿上。细菌在37℃条件下恒温培养24h，真菌在28℃条件下恒温培养48h，观察滤纸抑菌圈的大小，以滤纸片周围刚出现抑菌圈的最低提取物浓度为最低抑菌浓度3结果与分析3.1鱼腥草地上茎粗提物抑菌试验结果滤纸片法测定抑菌作用，取每菌四次重复测量抑菌圈直径（各萃取物对供试菌种的抑菌图见附图），比较鱼腥草地上茎提取液对各供试菌种的抑制作用强弱见表3.1。表3.1鱼腥草地上茎提取液对供试菌种的抑制作用强弱比较供试石油醚相乙酸乙酯相正丁醇相水溶液相空白菌种萃取物萃取物萃取物萃取物对照组金黄色葡萄球菌-++++++-大肠杆菌-++++++++-酵母菌++++-黑曲霉-----注：“-”表示抑菌圈不明显（Φ≤6mm）；“+”表示有一定的抑制作用（6mm＜Φ≤10mm）；“++”表示有较强的抑制作用（10mm＜Φ≤16mm）；“+++”表示抑制作用最强（Φ＞16mm）。由表3.1可以看出：（1）石油醚相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉无明显的抑制作用，对酵母菌有一定的抑制作用；（2）乙酸乙酯相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，对大肠杆菌的抑制作用最强，对酵母菌有一定的抑制作用，对黑曲霉无明显的抑制作用；（3）正丁醇相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌都有较强的抑制作用，对酵母菌有一定的抑制作用，对黑曲霉无明显的抑制作用；（4）水相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，对大肠杆菌的抑制作用最强、酵母菌有一定的抑制作用，对黑曲霉无明显的抑制作用。最小抑菌浓度的试验结果3.2.1石油醚萃取相最小抑菌浓度的试验结果上述各供试菌种，每系列浓度三次重复观察结果平均值见表3.2。从表3.2可以看出，石油醚相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉无明显的抑制作用，对酵母菌的最小抑菌浓度为0.1g/mL。乙酸乙酯萃取相最小抑菌浓度的试验结果上述各供试菌种，每系列浓度三次重复观察结果平均值见表3.3。从表3.3可以看出，乙酸乙酯相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌的最小抑菌浓度分别为0.06g/mL、0.02g/mL、0.1g/mL，对黑曲霉无明显的抑制作用。表3.2石油醚萃取相最小抑菌浓度的试验结果供试菌种石油醚萃取物溶液浓度（g/mL）空白对照0.10.080.060.040.020.01金黄色葡萄球菌-------大肠杆菌-------酵母菌+ ---- --黑曲霉-------注：“-”表示无抑制圈，“+”表示有抑制圈。表3.3乙酸乙酯萃取相最小抑菌浓度的试验结果供试菌种乙酸乙酯萃取物溶液浓度（g/mL）空白对照0.10.080.060.040.020.01金黄色葡萄球菌+++----大肠杆菌+++++--酵母菌+ ---- --黑曲霉-------注：“-”表示无抑制圈，“+”表示有抑制圈。正丁醇萃取相最小抑菌浓度的试验结果上述各供试菌种，每系列浓度三次重复观察结果平均值见表3.4。从表3.4可以看出，正丁醇相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌的最小抑菌浓度分别为0.04g/mL、0.04g/mL、0.1g/mL，对黑曲霉无明显的抑制作用。表3.4正丁醇萃取相最小抑菌浓度的试验结果供试菌种正丁醇萃取物溶液浓度（g/mL）空白对照0.10.080.060.040.020.01金黄色葡萄球菌++++---大肠杆菌++++---酵母菌+ ---- --黑曲霉-------注：“-”表示无抑制圈，“+”表示有抑制圈。水相提取物溶液的最小抑菌浓度的试验结果上述各供试菌种，每系列浓度三次重复观察结果平均值见表3.5。从表3.5可以看出，水相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌的最小抑菌浓度分别为0.04g/mL、0.02g/mL、0.1g/mL，对黑曲霉无明显的抑制作用。表3.5水溶液提取相溶液最小抑菌浓度的试验结果供试菌种水溶液提取相溶液浓度（g/mL）空白对照0.10.080.060.040.020.01金黄色葡萄球菌++++---大肠杆菌+++++--酵母菌+ ---- --黑曲霉-------注：“-”表示无抑制圈，“+”表示有抑制圈。4讨论4.1鱼腥草地上茎抑菌活性成分提取方法的探讨本次试验对原料有效成分的提取采用分段萃取法，依次得到四种不同极性大小的粗提物，极性从小到大依次为：石油醚相粗提物，乙酸乙酯相粗提物，正丁醇相粗提物，水溶液相粗提物。与目前对鱼腥草的抑菌成分活性的整体成分研究相比，本次研究通过对不同极性段的物质抑菌活性的研究，更加明确了具有抑菌活性的抑菌成分的存在部位，为更进一步的开发鱼腥草抑菌产品提供了理论依据。4.2鱼腥草地上茎粗提物抑菌活性测定方法的探讨本试验采用滤纸片法进行测定。与管碟法相比，滤纸片法操作简单，试验成本低，虽然抑菌效果的测定不如前者，但滤纸片法结果测定方便，广泛用于试验研究。结论通过本次试验研究，得出以下结论：（1）通过对鱼腥草地上茎四种粗提物抑菌试验可知：鱼腥草地上茎的石油醚相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉无明显的抑制作用，对酵母菌有一定的抑制作用；乙酸乙酯相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，对大肠杆菌的抑制作用最强，对酵母菌有一定的抑制作用，对黑曲霉无明显的抑制作用；正丁醇相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌都有较强的抑制作用，对酵母菌有一定的抑制作用，对黑曲霉无明显的抑制作用；水相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，对大肠杆菌的抑制作用最强、酵母菌有一定的抑制作用，对黑曲霉无明显的抑制作用。（2）通过对最小抑菌浓度的试验可知：石油醚相粗提物溶液对酵母菌的最小抑菌浓度为0.1g/mL；乙酸乙酯相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌的最小抑菌浓度分别为0.06g/mL、0.02g/mL、0.1g/mL；正丁醇相粗提物溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌的最小抑菌浓度分别为0.04g/mL、0.04g参考文献国家药典委员会编.中国药典[M].北京:化学工业出版社,2000:180-181.李冰昱,万启南.鱼腥草注射液治疗老年人肺炎的临床观察[J].国际中医中药杂志,2006,28(3):151.李朝友.新鱼腥草素钠注射液治疗小儿上呼吸道感染疗效观察[J].现代中西医结合杂志,2005,14(19):2531.胡静,何燕.新鱼腥草素钠注射液佐治毛细支气管炎疗效观察[J].现代中西医结合杂志,2006,15(5):578.孔微,口服蒲丁合剂合鱼腥草针雾化吸人治疗急性咽炎[J].浙江中西医结合杂志,2001,14(2):10.裴志强,魏良铜.新鱼腥草素钠联合病毒唑治疗流行性腮腺炎临床观察[J].中国临床保健杂志,2005,8:544.牛庆婷,马玉美.鱼腥草注射液合思密达治疗小儿秋冬季腹泻病43例[J].中医药临床杂志,2004,16(2):139.姜明全,周雄根,陈越.鱼腥草注射液佐治急性肾盂肾炎疗效观察[J].江西中医药,2006,37(3):25.张凤秀,生淑亭.超声监测鱼腥草注射液行子宫输卵管通液