孔雀石绿胶体金快速检测试剂板的研制及应用

孔雀石绿胶体金快速检测试剂板的研制及应用桑丽雅;王振国;柳爱春【摘要】为建立孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板,采用杭州南开日新生物技术有限公司实验室自制的包被抗原孔雀石绿卵清蛋白偶联物(MG-OVA)、抗孔雀石绿单抗作为原料，将各组分经过调试优化后组装成试剂板.结果表明，该试剂板对阴性水产样品的检测结果与液相-串联质谱法(LC-MS/MS)完全符合，对水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的最低检出限分别为1pg/kg和3pg/kg,整个检测所需时间约30min.该试剂板具有快速、灵敏、准确的特点.％Malachitegreen(MG)colloidalgoldrapidtestdeviceismainlymadefromMG-OVAdevelopedbyus,andanti-MGmonoclonalantibodywiththeoptimizedmixtureratio.TestingresultsshowthattherapidtestdeviceandLC-MS/MShavetheconsistentresultstotestnegativeseafoodsamplesthelowestdetectionlimitsforMGandleuco-MGarerespectively1pig/kgand3jig/kg,andthetestingtimeforonesampleisabout30minutes.Thistestdeviceisrapid,sensitiveandaccurate.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷)，期】2012(021)006【总页数】6页(P186-191)【关键词】孑L雀石绿;胶体金;人工抗原;单克隆抗体;快速检测【作者】桑丽雅;王振国;柳爱春【作者单位】杭州南开日新生物技术有限公司，杭州310022；杭州南开日新生物技术有限公司杭州310022；杭州市农业科学研究院杭州I310024【正文语种】中文【中图分类】R392.12孔雀石绿（分子式C23H25CIN2，又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿）是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料，过去常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂。1933年起其作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂在水产中使用，后曾被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等，特别在治疗水霉病上具有非常有效的作用。但由于孔雀石绿具有高毒、高残留及〃三致”（致畸、致癌、致突变）等副作用，因此世界上许多国家已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物，中国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》（农业部第193号公告）。虽然孔雀石绿已被列为水产养殖禁用药，但因为其价格低廉，在水霉病防治方面尚无很好的替代品，同时缺乏有效的监督管理，因此目前仍有不少单位在违规使用［1-2］。孑L雀石绿的检测方法，通常采用高效液相色谱（HPLC）及液-质联用（LC-MS）等方法［3-5］。然而，这些方法需要较长的检测时间、繁琐的检测步骤及相应昂贵的实验设备，主要被限制在实验室中使用。随着人们对食品安全的日益重视和进出口贸易的高速增长，迫切需要一种能快速、稳定地检测农、兽药残留的方法。近年来发展迅速的胶体金免疫层析法具有前处理简单、检测周期短、检测灵敏度高、对操作人员要求低、不需要昂贵的仪器设备等优点，被认为是目前最具应用价值和发展潜力的快速痕量分析技术之一。本研究建立了水产品中孔雀石绿残留的免疫胶体金快速分析方法。1材料与方法1.1材料1.1.1试剂孔雀石绿（MG）、隐性孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐性结晶紫（LCV）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、聚乙二醇20000、弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）、HT培养基和HAT培养基均购自美国Sigma公司，96孔细胞板（丹麦Nunc公司），96孔酶标板（德国greiner公司），氯金酸（HAuCl4・4H2O）、羊抗鼠IgG均购自美国Sigma公司，乙腈、正己烷、二氯甲烷和中性氧化铝购自华东医药有限公司，硝酸纤维素膜（NC）、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫均购于Millipore公司，酶标微孔购于美国corning公司。其他化学试剂均为分析纯。1.1.2仪器AvantiJ-26XP高速冷冻离心机（美国Becman公司）、WJ-H型CO2细胞培养箱（上海跃进医疗器械厂）、680型酶标仪（美国BIORAD公司）、UV-2802紫外连续扫描分光光度计（美国UNICO公司）、78HW-1恒温磁力搅拌器（杭州仪表电机有限公司）、恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、BioJetXYZ3000型点膜仪（美国BioDot公司）、切割机（杭州市恒通设备有限公司）。1.2方法1.2.1孔雀石绿免疫抗原及包被抗原的制备参照文献［6］介绍的方法进行。1.2.2人工抗原的鉴定及偶联比的测定参照文献［6］介绍的方法进行。1.2.3孑L雀石绿单克隆抗体的制备和纯化按照常规方法［7］制备即可。1.2.4孔雀石绿单克隆抗体效价测定及特异性分析将制备的人工抗原按间接ELISA操作程序［8］进行测定。以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍者，判为阳性，以判为阳性的最高稀释倍数为效价判定终点稀释度。将孔雀石绿标准品及隐性孔雀石绿、结晶紫及隐性结晶紫标准品做梯度稀释，分别与包被抗原MG-OVA做间接竞争ELISA，计算IC50。由交叉物的IC50与孔雀石绿的IC50之比计算交叉反应率，计算公式如下：交叉反应率=IC50/IC'50x100%，式中，IC50表示抗孔雀石绿单抗对孔雀石绿的半抑制质量浓度，IC'50表示抗孔雀石绿单抗对隐性孔雀石绿、结晶紫及隐性结晶紫的半抑制质量浓度。1.2.5试剂板各组分的优化和组装用点膜机把适当质量浓度的包被抗原MG-OVA及羊抗鼠IgG喷在NC膜上，分别作为检测线（T线）和控制线（C线）。MG-OVA、羊抗鼠IgG和金标抗体包被量的选择方法如下：在T线粗调范围（0.6-1.0g/L）内和C线粗调范围（0.6~1.5g/L）内，选择一组质量浓度，按常规喷量0.8~1.0"/cm包被到NC膜上，60°C干燥箱放置2h。将制备好的金标记抗孔雀石绿单克隆抗体选择不同包被量（0.3~0.5mg/L）包被到酶标板微孔中，33C烘箱干燥12h。按图1所示，将NC膜与样品垫、空白胶体金结合垫、吸水垫、底板组装成试纸条。用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐（PBS）缓冲液和含却g/L孔雀石绿的标准品溶液各100pL充分溶解微孔中的金标抗体后，分别进行试纸条滴定，观察显色变化和试纸条灵敏度，反复调试，最终选择显色深浅适中、灵敏度最高、梯度最大的一组质量浓度作为最终配比。1.2.6样品前处理取鱼、虾等水产样品的可食肌肉部分，用均质机均质；称取2g均质后，样品于15mL离心管中；移取1mL混合提取液（对甲苯磺酸0.2g,盐酸羟胺0.1g，乙酸胺0.2g,加蒸馏水溶解，定容至500mL，用4mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.5）加入到离心管中，振荡30s;将4mL乙腈加入到离心'管中，振荡30s，将2g中性氧化铝加入到离心管中，剧烈振荡2min;室温下4000r/min离心5min;取3mL上清于新的5mL离心管中，移取2mL正己烷加入到离心管中，振荡1min，室温下4000r/min离心1min，弃去上清；取2mL下层于5mL离心管中，移取1mL二氯甲烷加入到离心管中，振荡1min,室温下4000r/min离心1min;弃去上层液体，取1mL下层液体于玻璃试管中，加入100pLw=1%的重铬酸钾溶液，在60OC的水浴或空气吹干仪中，用氮气或空气吹干；向吹干的试管中加入0.3mL含w=0.05%吐温-20的pH7.4的磷酸盐（PBST）缓冲液，冲洗溶解试管内壁上残留物，吸取至少0.1mL溶液，彳寺检。图1孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板结构Fig.1Structurediagramofmalachitegreen（MG）colloidalgoldrapidtestdevice1.样品垫Samplepad;2.胶体金结合垫Colloidalgoldconjugatepad;3.硝酸纤维素膜NCmembrane;4.检测线Testline;5.控制线Controlline;6.吸水垫Absorbentpad;7.不干胶Stickers;8.PVC底板PVCsoleplate1.2.7样品测定吸取100pL待检样品溶液于包被金标抗体的微孔中，用滴管吹打均匀，静置反应5min，吸取全部混合溶液于试剂板加样孔中，加样后开始计时，结果应在5~8min读取，其他时间判读无效，读取结果时，试剂板应置于观察者正面，如图2右侧所示。1.2.8检测结果判读当待检样品溶液滴加到加样孔后，样品溶液中的孔雀石绿与固定在T线上的MG-OVA复合物竞争结合抗孔雀石绿单抗-胶体金复合物，可出现以下几种情况（图3）。阴性（-）：T线显色比C线深或一样深，表明样品中孔雀石绿含量低于1pg/kg（隐性孔雀石绿含量低于3pg/kg），或无孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留。阳性（+）：T线显色比C线浅，或T线无显色，表明样品中孔雀石绿含量高于1pg/kg（隐性孔雀石绿含量高于3pg/kg）,T线比C线越浅，表明样品中孔雀石绿、隐性孔雀石绿含量越高。图2孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板操作Fig.2Operationchartofmalachitegreen（MG）colloidalgoldrapidtestdeviceS.加样LSamplewell;C.控制区Controlwindow;T.检测区Testwindow无效：未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。1.2.9阴性水产样品的测定取经过LC-MS/MS（GB/T19857-2005水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定）确证的水产品阴性样品共11个，品种分别涉及白鲢、草鱼、鳙鱼、鲟鱼、鲤鱼、鲫鱼、南美白对虾、罗氏沼虾、青虾、中华瞥和河蟹，每个样品做7个平行，样品前处理完成后，用本试验研制的孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板进行检测。1.2.10试剂板最低检出限测定11个经LCMS/MS确证的阴性水产样品分别添加不同质量分数的孔雀石绿标准溶液和隐性孔雀石绿标准溶液，添加质量分数分别为0、0.25、0.5、1、2、3、5、10和20pg/kg，用孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板检测，观察显色结果。2结果与分析2.1孔雀石绿人工抗原的鉴定及偶联比分析MG、BSA和孔雀石绿-牛血清蛋白偶联物（MG-BSA）的紫外扫描图谱见图4。由图4可知，BSA的特征吸收峰在近280nm处，MG的特征吸收峰在近618nm处，偶联物MG-BSA的UV图谱与前两者相比发生明显的偏移和变化，根据吸光度加合性原理，可以判定孔雀石绿已经偶联在BSA上。再根据杨利国等［9］方法计算出MG-BSA的偶联比为17:1。2.2孔雀石绿单克隆抗体特异性分析孑L雀石绿单克隆抗体与结构类似物的交叉反应结果见表1。可见：孔雀石绿单克隆抗体与结构类似物结晶紫的交叉反应率为100%，与隐性孔雀石绿、隐性结晶紫的交叉反应率均＜1%。2.3试剂板各组分分析将不同质量浓度的MG-OVA、羊抗鼠IgG和金标抗体分别包被到NC膜和金标微孔中组装成试剂板，经过反复调试，最终确定一组最佳质量浓度配比，具体参数如下：检测线上用质量浓度为0.8g/L的MG-OVA包被，包被量为1.0pL/cm;控制线上用质量浓度为1.0g/L的羊抗鼠IgG包被，包被量为0,8pL/cm;金标微孔用质量浓度为0.4mg/L金标抗体包被，包被量为每孔10"。图3孑L雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板结果判断Fig.3Resultsofmalachitegreen(MG)colloidalgoldrapidtestdeviceC.控制线Controlline;T.检测线Testline图4MG、BSA和MG-BSA紫外扫描图谱Fig.4UVabsorbencyspectrumofMG,BSAandMG-BSA曲线上的数字表示波峰出现的位置和数量Figuresonthecurverepresentthelocationandnumberofpeaksappear表1孑孑雀石绿单克隆抗体与结构类似物的交叉反应性Table1Cross-reactivityofmalachitegreenmonoclonalantibodywithrelatedstructuralanalogue化合物Compound半抑制质量浓度IC50/(mg/L)Halfinhibitoryconcentration交叉反应率CR/%Crossreactionratreen1.66100e孑1雀石绿Malachiteg隐性孔雀石绿Leucomalachitegreen>166<1结晶紫Crystalviolet1.7296.5隐性结晶紫Leucocrystalviolet>166<12.4阴性水产样品分析11个经LC-MS/MS确证的阴性水产样品，用本研究制备的孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板检测，检测结果全部显示阴性，没有检出假阳性样品，表明试剂板对11个水产样品的假阳性率为0%。2.5试剂板最低检出限分析11个经LC-MS/MS确证的阴性水产样品，分别添加不同质量分数的孔雀石绿和隐性孔雀石绿，样本处理后用孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板检测，显色结果分别见图5和图6。从图中可以看到，随着添加质量分数的升高，检测线(T线)显色强度呈梯度递减。孔雀石绿添加质量分数小于1.0pg/kg时，检测线比控制线显色深或一样深，孔雀石绿添加质量分数大于等于1.0pg/kg时，检测限显色比控制线浅，添加质量分数大于20pg/kg时，检测线完全消失。隐性孔雀石绿添加孔雀石绿小于3.0pg/kg时，检测线比控制线显色深或一样深，隐性孔雀石绿添加质量分数大于等于3.0pg/kg时，检测限显色比控制线浅，添加质量分数大于20pg/kg时，检测线完全消失。图5不同质量分数孔雀石绿标准品滴板后显色变化Fig.5Colorchangesofplatesdroppedwithdifferentmassfractionofmalachitegreen(MG)standardsubstances图6不同质量分数隐性孔雀石绿标准品滴板后显色变化Fig.6Colorchangesofplatesdroppedwithdifferentmassfractionofleuco-MGstandardsubstances由此初步确定，本试剂板对水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的最低检测水平(LDL)可达到1.0和3.0pg/kg。3讨论3.1试剂板各组分的优化MG-OVA、羊抗鼠IgG和金标抗体包被量是决定试剂板灵敏度的3个主要变量。T线上MG-OVA包被量过小，显色太浅，会影响视觉效果，反之包被量过大，虽然显色深，但是灵敏度会降低。金标抗体标记量是由具体抗体的特性决定的，调试过程主要变化的是金标抗体的包被量，包被量的选择依据同T线，一是看显色深浅，二是看灵敏度高低。具体调试过程中，需要用粗调和微调相结合的方式，反复调试，最终确定一组最佳配比。目前，金标抗体有2种包被方式。一种是直接包被在胶体金结合垫上，与其他组件（样品垫、NC膜、吸水纸、背衬等）一起组装成试纸条；另一种是包被到酶标板微孔中，用空白胶体金结合垫进行组装。2种方式各有利弊，前一种方式优点在于样品前处理完成后，可一步式进行检测，操作方便；后一种方法的优势在于试剂板灵敏度更高，但增加了一步操作，较为繁琐。考虑到本试剂板灵敏度所需，本研究选取将金标抗体包被到酶标微孔中的方法。但如果抗体的IC50够小，能够满足实际检测灵敏度所需，以选择前一种方法为宜。3.2样品前处理方法的优化3.2.1提取条件孑1雀石绿，易溶于水，溶于乙醇、甲醇和戊醇。考虑到孔雀石绿是在酸性条件下容易被提取出来。本试验研究多种酸性溶液，最后选取一种pH4.5的混合提取液（对甲苯磺酸0.2g,盐酸羟胺0.1g，乙酸胺0.2g,加蒸馏水溶解，定容至500mL，用HCl和NaOH调pH至4.5），主要作用是破坏组织样品，将孔雀石绿提取出来。为了使提取的孔雀石绿达到浓缩的效果，需要用有机溶剂提取剂将孔雀石绿从混合提取液中萃取出来。市面上的孔雀石绿快速检测试剂盒普遍采用乙腈作为提取剂，经本研究验证，乙腈提取效果很好。但是乙腈与水是无限互溶的，所以需要将混合提取液中的水分消除掉。本试验研究过氧化铝柱、添加中性氧化铝、用二氯甲烷反萃取3种方法，发现乙腈提取后，过氧化铝柱和添加中性氧化铝效果一致，均好于用二氯甲烷反萃取，考虑到过氧化铝柱步骤较繁琐且费时，所以采用添加中性氧化铝来除去水分。3.2.2净化条件样品中的孔雀石绿被提取后，为了提高检测灵敏度，需要用相应的净化剂进行净化，主要作用是除去脂肪等杂质。使用的净化剂需要满足与乙腈不互溶的性质，可用的净化剂有正己烷、二氯甲烷、氯仿和四氯化碳等，但是氯仿和四氯化碳毒性较大，考虑到试剂的安全性，及提高净化效果，最终选取正己烷和二氯甲烷作为净化剂，并设置2步净化步骤。3.3免疫胶体金层析检测技术的应用前景当前水产品中孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留检测主要方法是液质联用法(LC-MS、LC-MS/MS)，该法灵敏度高、准确度好，但操作繁琐费时，需要配备昂贵的液质仪，且对操作人员的技术要求高，在基层应用推广中受到阻力。运用免疫胶体金快速层析技术对水产品中孔雀石绿及隐性孔雀石绿残留进行快速筛选，操作简单，能在30min左右完成样本检测全过程，不需要用到复杂的仪器设备，对检测人员操作水平要求低，且检测成本低廉，是药物残留快速检测发展的趋势。免疫胶体金层析检测技术作为一种快速筛选手段，在现场监控和基层检测中具有广阔的应用前景。4小结本试验研制一种孔雀石绿免疫胶体金试剂板，采用杭州南开日新生物技术有限公司实验室自制的包被抗原MG-OVA、抗孔雀石绿单抗(效价1:128000,IC50=1.66pg/L)作为原料，各组分经过调试优化后组装成试剂板。经试验，该试剂板对阴性水产样品的检测结果与LC-MS/MS法完全符合，对水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的最低检出限分别为却g/kg和3pg/kg，整个检测所需时间约30min，仅需配备几个简单的小型仪器，能够满足现场检测需要，有望帮助形成〃筛检+确证”的政府检测监管模式，加快对市场和产地水产品质量安全的信息反馈，实行市场准入制度。参考文献：[1]FosterFJ,Woodburyl.Theuseofmalachitegree