双向电泳详解演示文稿

双向电泳详解演示文稿目前一页\总数七十页\编于七点（优选）双向电泳目前二页\总数七十页\编于七点应用对象：蛋白质混合物的分离运动方向：等电聚焦电泳（水平方向）-重点SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（垂直方向）

目前三页\总数七十页\编于七点1994年Wilkin和Williams提出蛋白质组这一概念后，蛋白质组在生物学界得到了充分关注，而蛋白质组的开门技术———双向电泳由O’Farrell于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白。目前四页\总数七十页\编于七点蛋白质组学蛋白质组学：研究一种生物或一种细胞组织内全部蛋白质组成及其活动规律的科学。可视为分子生物学的大规模筛选技术，

目的在于：1.归类细胞中的蛋白质的整体分布；2.鉴定并分析感兴趣的个别蛋白；3.最终阐明它们的关系与功能。目前五页\总数七十页\编于七点蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。双向电泳技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。对于蛋白质组学的研究来说，它的最基本的实验手段就是利用双向凝胶电泳在整个基因组水平上检测蛋白质表达的情况。目前六页\总数七十页\编于七点双向电泳(2DE/DIGE)实验组和对照组样品制备提出生物学问题凝胶图像分析差异蛋白点选取蛋白酶解及质谱分析差异蛋白点的成功鉴定生物学问题的解释蛋白质组学技术流程

目前七页\总数七十页\编于七点目前八页\总数七十页\编于七点双向电泳技术应用中的关键步骤：1、样品制备（蛋白提取）：（1）细胞培养、处理和收集；（2）将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解；（3）将样品离心以去除不溶的细胞碎片和DNA，提取

上清，-80℃保存。2、蛋白质定量和上样：（1）固相PH梯度干胶条（immobiline

PH

Gradient,IPG）水化、等电聚焦；（2）IPG的平衡；（3）SDS；(4)蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色；3、图像分析及数据处理：

将染色后凝胶放在光密度扫描仪上，扫描后的图像用PDQUEST2DE软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行比较。目前九页\总数七十页\编于七点双向电泳的作用和地位双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。目前十页\总数七十页\编于七点双向电泳定义

双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis)是

一种平板电泳技术，是等电聚焦胶电泳和SDS的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照PI分离），然后再进行SDS(按照分子大小），样品中的蛋白经过等电点和分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、分子质量和表达量等信息。

目前十一页\总数七十页\编于七点由于2DE是依据蛋白质的两种不同性质，即等电点和分子量进行分析，因此分辨率远高于其它任何一种单一的电泳方法，是目前分析混合蛋白质样品最有效的手段。另外，经染色得到的电泳图，是个二维分布的蛋白质图并且双向电泳分离的结果是蛋白质呈现斑点状而不是条带状。目前十二页\总数七十页\编于七点胶性PH9中电加解入质了溶双液

PH3加上电场后建立稳定PH梯度蛋白质溶液加入，建立电场染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开第一向等电聚焦PI逐渐降低等电聚焦胶放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶上

第二向SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量逐渐降低PI逐渐降低

双向凝胶电泳示意图目前十三页\总数七十页\编于七点目前十四页\总数七十页\编于七点目前十五页\总数七十页\编于七点2DE仪器系统恒温水浴垂直板电泳仪（第二向）电源等电聚焦仪（第一向）目前十六页\总数七十页\编于七点双向电泳的优缺点优点：根据电荷差异和分子大小分离蛋白，因此能分离分子电荷相同但分子大小不同或者同分异构体（分子量相同但构象不同）以及经过翻译后修饰的蛋白（如电荷数不同的磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，在双向电泳胶上出现一串水平斑点）。缺点：不能分离疏水性及强酸强碱性蛋白；不能分离低丰度蛋白；灵敏度受样品量限制及染色效果影响；不能完全自动化，耗时较长。目前十七页\总数七十页\编于七点双向电泳经典工作流程1、样品制备的基本步骤：⑴破碎、⑵沉淀、⑶溶解、⑷去除杂质2、等电聚焦电泳3、两维间的平衡4、SDS—PAGE电泳5、染色6、结果分析目前十八页\总数七十页\编于七点样品处理

一般性原则：样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：1.尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2.减少对蛋白质的人为修饰；3.破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。目前十九页\总数七十页\编于七点样品制备的基本步骤破碎——最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原则

机械破碎捣碎法、研磨法、匀浆法

物理破碎温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法

化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法、外加酶制剂法目前二十页\总数七十页\编于七点沉淀蛋白——可溶性是关键

硫酸铵沉淀法三氯乙酸(TCA)沉淀法丙酮沉淀法TCA-丙酮沉淀法醋酸铵沉淀法

目前二十一页\总数七十页\编于七点样品的溶解——是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一

样品的溶解直接关系到分离的分辨率，为使尽可能多的蛋白质溶解，必须完全破坏分子间的相互作用，把蛋白质复合物解聚和变性为单体形式，使其在整个分离过程以多肽链形式存在，同时要避免对蛋白质的任何化学修饰。目前二十二页\总数七十页\编于七点溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态目前二十三页\总数七十页\编于七点增加样品溶解性的手段一些疏水蛋白尤其是膜蛋白很难溶解，为了促进其溶解，常加入一些增溶剂如变性剂、表面活性剂、还原剂等。1.变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心充分暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。尿素是2D中最常用的变性剂，其作用是可逆的，在凝胶中的浓度必需保持在8mol/L以上。过低则达不到完全溶解样品的目的，当尿素与硫脲结合使用时，极大地提高了膜蛋白的溶解。由于硫脲难溶于水，高浓度的尿素能促进硫脲的溶解，因此2mol/L硫脲常在5-7mol/L尿素浓度下使用，硫脲浓度大于2mol/L会降低等电聚焦(IEF)分辨率。目前二十四页\总数七十页\编于七点2.表面活性剂：

经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。强离子型去垢剂如SDS会影响蛋白所带的电荷，不适合在等电聚焦中使用，因此尽量选用非离子型或两性离子表面活性剂，从而保证蛋白质仅依靠其自身的电荷进行移动，其中CHAPS和SB3-10最好。3.还原剂：

在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或β-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP)进行还原。目前二十五页\总数七十页\编于七点4.起载体作用的两性电解质

即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。

Carrierampholytes的作用于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2%（W/V)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同PH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。目前二十六页\总数七十页\编于七点去除杂质——关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰在样品中常常会含有像核酸、多糖、去污剂和代谢物等非蛋白杂质，需要去除，否则会影响双向电泳的结果，这个过程有时会造成蛋白的丢失以及蛋白的化学修饰和解聚，特别是后者会导致双向电泳图谱中蛋白点的增多（由于电荷的改变），所以操作中要多加注意。1.核酸的清除对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决的方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA)同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。2.多糖的清除对电泳的影响：带负电的多糖会与蛋白形成复合物导致拖尾影响聚焦。解决的方法：利用超离心和高pH,高离子强度和TCA等沉淀法。目前二十七页\总数七十页\编于七点3.去污剂的清除对电泳的影响：SDS能与蛋白形成带负电的复合物，对等电聚焦影响大，需要清除。解决的方法：用含载体的两性电解质或两性离子去污剂（CHAPS、TritonX-100或NP-40)溶胀液稀释，或者丙酮沉淀法。4.盐离子和外源带电小分子的清除对电泳的影响：样品中的盐会增加凝胶条的电导，使其无法达到设置的电流，从而影响蛋白质聚焦，带电小分子会引起水的流动，使胶条的一端肿胀而另一端变干，导致两端的酸、碱性蛋白无法聚焦，造成拖尾或丢失。解决的立法：常用透析去除盐成份，TCA-丙酮沉淀法可以清除小分子。目前二十八页\总数七十页\编于七点定义：等电聚焦电泳是一种利用有pH值梯度的介质，

分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。

将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。

06-05净电荷与PH的关系曲线

第一向分离等电聚焦电泳目前二十九页\总数七十页\编于七点等电聚焦电泳进行过程中等电聚焦电泳结束后（－）（－）高pH高pH低pH低pH目前三十页\总数七十页\编于七点

等电聚焦原理蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。目前三十一页\总数七十页\编于七点

等电聚焦的特点优点：1.有很高的分辨率，可将等电点相差0.01～0.02PH单位的蛋白质分开；2.一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时间和所走距离加长，区带越走越宽，而电聚焦能抵消扩散作用，时间越长，聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率；3.由于这种电聚焦作用，不管样品加在什么部位，都可聚焦到其等电点处，很稀的样品也可进行分离；4.可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01PH单位。目前三十二页\总数七十页\编于七点缺点：1.电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀，2.样品中的成分必需停留于其等电点，不适用于在等电点时发生沉淀或变性的蛋白质目前三十三页\总数七十页\编于七点等电聚焦电泳三种系统

根据第一向等电聚焦条件的不同，可将2DE分为三种系统：1.

第一种系统：是在聚丙烯酰胺凝胶中进行，在外加电场作用下,两性电解质在管胶内建立pH梯度，随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移,同时重复性差，上样量低；2.第二种系统：第一向电泳,IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，该系统PH梯度稳定，不依赖于外加电场，无论是重复性和上样量均优于第一种系统；3.第三种是非平衡PH梯度电泳，主要用于分离碱性蛋白质，电泳展开时间相对比较短。目前三十四页\总数七十页\编于七点固相pH梯度等电聚焦电泳技术

固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电聚焦技术。固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法之一。目前三十五页\总数七十页\编于七点固相pH梯度的建立固相pH梯度等电聚焦技术的突破要归功于Immobilines试剂（AmershamPharmaciaBiotech,APB）的基础上开发的固相pH梯度（IPG）技术。Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱酸弱碱性质的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有类似的聚合行为。每个分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连，其结构式为：

其中R包含羧基或叔氨基团，分子一端的双键可以在聚合过程中共价键合镶嵌到聚丙烯酰胺介质中,所以它是固相的，即使是在电场中也不会漂移。分子另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终点附近一段pH范围就可形成近似线性的分布在pH3～10范围的缓冲体系。

目前三十六页\总数七十页\编于七点所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。目前三十七页\总数七十页\编于七点固相pH梯度聚丙烯酰胺凝胶基质结合缓冲基团

目前三十八页\总数七十页\编于七点在固相pH梯度的发展中，为了改善结果，简化操作，把IPG胶灌到塑料支持膜上形成商品化的固定干胶条，即IPG胶条。固定干胶条（immobilinePHgradients,IPG）的概念：胶条由基质和聚丙烯酰胺形成一个整体，PH梯度的产生是由酸性和碱性基团与聚丙烯酰胺以梯度式共价键连接而形成。即使在电场中，它也是“固相”的。目前三十九页\总数七十页\编于七点不同pH范围胶条不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是1个pH范围pH7-11NL碱性胶条目前四十页\总数七十页\编于七点宽pH、窄pH范围胶条宽pH梯度胶条应用: 整个蛋白图谱窄pH梯度胶条应用: 提高分辨率 增加样品上样量 检测分析更多蛋白pH345678910456789目前四十一页\总数七十页\编于七点提高分辨率:斑点显现IPG4-7IPG5-6IPG4-7MouseliverproteinsFromA.Görgetal.(1999)目前四十二页\总数七十页\编于七点不同长度的胶条7cm11cm

13cm18cm24cm目前四十三页\总数七十页\编于七点小尺寸胶条的电泳时间短，可用于优化样品制备等预实验；而大尺寸胶条的电泳时间长，用于对复杂样品进行更为彻底的分析并鉴定出感兴趣蛋白。目前四十四页\总数七十页\编于七点线形与非线形胶条linear(L)nonlinear(NL)由于生物体中大部分蛋白等电点在pH4-8之间，线性宽pH范围的胶条可以在同一块胶上显示样品中绝大多数蛋白，但大量的蛋白点都集中在胶条的中间，两端的蛋白点较少，从而造成中间部分的分辨率低。非线性胶条将pH4-8之间的距离相对拉大，而两端pH范围的距离相对缩短，因此可以较好的分离大部分pH4-8的蛋白质。目前四十五页\总数七十页\编于七点IPGIEF中pH梯度的选择常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。目前四十六页\总数七十页\编于七点Immobiline™干胶条的特性1.可重复性2.无梯度漂移,真正的平衡方法3.可分离酸性和碱性蛋白4.容纳蛋白样本量更多5.水平和垂直SDS凝胶中都能使用6.允许样本水化上样7.机械强度和尺寸稳定8.易操作9.易于对样本跟踪标记目前四十七页\总数七十页\编于七点IPG胶条的水化商品化的胶条使用前是以干胶条的形式和塑料支持薄膜粘在一起，加样前需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡胀，使其重性水化膨胀成凝胶，其中孔径扩张至最大，使样品能够充分进入凝胶内，完成上样。重胞胀液的成分是：8mol/L

urea，2%CHAPS，18mmol/LDTT,0.5%IPGBuffer,痕量溴酚蓝.重泡胀在等电聚焦盘内进行。泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。重泡胀时间：至少10h,12-16小时，泡胀不充分会影响相对分子量较高的蛋白质的吸收。目前四十八页\总数七十页\编于七点等电聚焦实验步骤一．

加样品水化1.用样品溶解缓冲液溶解样品。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。2.吸取适量(见表)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。目前四十九页\总数七十页\编于七点IPG胶条所需水化液体积胶条长度（cm)每条需水化液体积（ul)712511200132501835024450目前五十页\总数七十页\编于七点3.从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。4.IPG胶条上覆盖适量ImmobilineDryStrip覆盖油，盖上盖子。5.将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与IPGphor仪器的阴极平台接触。6.设置IPGphor仪器运行参数：IPG胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。目前五十一页\总数七十页\编于七点目前五十二页\总数七十页\编于七点聚焦时间的优化理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。目前五十三页\总数七十页\编于七点等电聚焦电压设置低压水化：50V-12h缓慢升压除盐：100V-1h，200V-1h，500V-1h，1000V-1h，1000-10000V-1h高压聚焦：10000V-10h低压维持：500V-nh等电聚焦的电压上升分为三个阶段：1.首先加上一个比较低的电压，去除胶条中过多的盐离子；2.然后开始加高电压，电压上升的模式为缓慢上升；3.最后是持续高压，电压上升的模式为快速上升。目前五十四页\总数七十页\编于七点IEF的基本条件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid目前五十五页\总数七十页\编于七点TheIPGphor™Platform目前五十六页\总数七十页\编于七点两维间的平衡一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于-80℃保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS中电泳能顺利进行。平衡过程会导致蛋白丢失约5%-25%，还会使分辨率降低，平衡30min,蛋白带变宽40%，缩短平衡时间可以减少扩散，但时间太短时蛋白质没有被SDS充分包裹，容易产生水平条纹。同时会减少向第二向的转移，所以平衡时间要充分长（至少2×10min),但不要超过2×15min。目前五十七页\总数七十页\编于七点IPG胶条的平衡—两步平衡目的：是使蛋白质与SDS充分的相互作用，使蛋白质根据

分子量大小而进行第二向迁移。

SDS电泳前,采用两步平衡法平衡母液:1.2%SDS；2.50mMTris-HClpH8.8；

3.6Murea,30%glycerol；

甘油和尿素降低电内渗作用，有利于蛋白从第一向到

第二向的转移。

目前五十八页\总数七十页\编于七点

第一步平衡在平衡液中加入DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的DTT烷基化(银染过程中，去除多余的DTT,DTT会导致点拖尾”pointstreaking”)。将IPG胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向SDS胶中。目前五十九页\总数七十页\编于七点第二向分离

SDS电泳

双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。原理：低离子强度时，SDS主要以单体形式存在，此时它可以与蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物。当SDS单体浓度大于1mmol/L时，它与多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，从而