二代测序技术在医学领域中的应用

二代测序技术在医学领域中的应用魏冬凯目前一页\总数六十六页\编于十九点概要二代测序技术简介常见医学领域NGS方案石蜡包埋样本解决方案CTC和ctDNA目前二页\总数六十六页\编于十九点二代测序技术简介目前三页\总数六十六页\编于十九点人类基因组

HumanGenome30亿对碱基来自母亲30亿对碱基来自父亲线粒体基因组来自母亲与人类共生的微生物基因组目前四页\总数六十六页\编于十九点DNA的构成目前五页\总数六十六页\编于十九点末端终止法测序目前六页\总数六十六页\编于十九点ABI3700(ABI3730)目前七页\总数六十六页\编于十九点人类基因组计划(HGP)人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的设想，最终要把人体内约4万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。被誉为生命科学的“登月计划”。目前八页\总数六十六页\编于十九点CeleraGenomicsCraigVenter成立第一个使用全基因组鸟枪法测序使用330台ABI3700，购买当时世界排名第三的服务器进行运算，花费3个月时间对Venter的基因组进行测序，得到20GB数据。目前九页\总数六十六页\编于十九点Ventor基因组测序基于分子克隆，必须将DNA片段克隆至大肠杆菌中，否则无法测序。每次末端终止反应体系10ul，其中含有1013个DNA分子，但每次只能测其中1条。预计花费2亿美金，最终花费30亿美金！怎样才能降低试剂消耗？目前十页\总数六十六页\编于十九点降低消耗的办法1.将分子克隆替换成聚合酶链式反应（PCR），先给DNA片段加上尾巴。

桥式PCR2.降低反应体积把测序反应装到小的空间里去。10ul的试剂做更多的DNA测序反应。目前十一页\总数六十六页\编于十九点降低消耗的办法1.将分子克隆替换成聚合酶链式反应（PCR），先给DNA片段加上尾巴。

桥式PCR2.降低反应体积把测序反应装到小的空间里去。10ul的试剂做更多的DNA测序反应。目前十二页\总数六十六页\编于十九点桥式PCR目前十三页\总数六十六页\编于十九点二代测序（NGS）目前十四页\总数六十六页\编于十九点边合成边测序（SBS）Flowcell目前十五页\总数六十六页\编于十九点SBS技术特点读长最初的时候只有31bp，现已能达到600bp。运行时间长，荧光信号会逐渐减弱。每次只能结合1个碱基，发出一种荧光信号。目前十六页\总数六十六页\编于十九点Hiseq2500可同时运行2张8通道flowcell有高通量模式和快速模式2种模式。单次运行数据量高达500GB。快速模式最短运行时间17小时。目前十七页\总数六十六页\编于十九点常见医学领域NGS方案目前十八页\总数六十六页\编于十九点二代测序应用医疗的可行性目前十九页\总数六十六页\编于十九点NGS的优势相比于一代测序，NGS更加省时低成本，速度快，覆盖度深，准确度高；高通量测序人类基因组有助于发现与疾病相关的未知基因；对于疾病引起的基因突变，高通量测序可以为患者医师提供更为准确的诊断依据；需求样本类型广泛，样本量需求少。目前二十页\总数六十六页\编于十九点常见医学领域NGS方案全基因组重测序（WGRS）寻找个体突变，InDel，CNV，SV等等，需求数据量大，单个样本需求90G数据。全外显子组测序（WES）捕获基因组中的全外显子进行测序，测序数据量较WGRS少很多，并能获得高测序深度（50X-150X）目前二十一页\总数六十六页\编于十九点常见医学领域NGS方案靶向区域测序（TargetSequencing）捕获富集感兴趣的靶向区域进行测序，技术流程与全外显子捕获相似，测序需求量较WES少，能获得更高测序深度（最高500X）转录组测序（RNA-Seq）研究转录水平上的测序，包括mRNA，lncRNA，microRNA等。目前二十二页\总数六十六页\编于十九点全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。全基因组重测序(WGRS/DNA-Seq)目前二十三页\总数六十六页\编于十九点SNP（个体间差异）CNV（大片段基因拷贝数变异）InDelSV（结构变异）全基因组重测序的应用目前二十四页\总数六十六页\编于十九点SNP(SNV)目前二十五页\总数六十六页\编于十九点示例目前二十六页\总数六十六页\编于十九点为何研究SNP？SNP目前已被公认为疾病发生的基因分子标记。SNP被认为是导致药物差异化的主要因素之一，因此可以根据SNP的变化来进行个性化用药。SNP分布广泛，且较为稳定。某些SNP会直接影响功能基因表达。目前二十七页\总数六十六页\编于十九点大多数的SNP都是无用的大多数的SNP属于沉默突变。非编码区的错义突变也不会导致蛋白质发生改变。目前二十八页\总数六十六页\编于十九点但也有例外目前二十九页\总数六十六页\编于十九点诊断实例：Dr.JamesGern和JosephDeRisi合作，用MiSeqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体的序列，从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染。Dr.JamesGern依据上述的判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩的病。脑脊液是较难取得的体液，只能是采集很少的量，这就限制了所能得到的核酸总量。钩端螺旋体，在病原体的常见程度排名中是较靠后的种类。在本案例中，如果用PCR方法，挨个排查病原体，可能还没排到钩端螺旋体，核酸就不够了。但高通量测序克服了核酸量不够的问题。在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体的DNA，这让钩端螺旋体无处循形。目前三十页\总数六十六页\编于十九点2009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。Kuroda,M.,Katano,H.,Nakajima,N.,Tobiume,M.,Ainai,A.,Sekizuka,T.,…Sata,T.(2010)..PloSOne,5目前三十一页\总数六十六页\编于十九点Nimblegen

(Roche)SureSelect(Agilent)RNAOligoTrusight

(Illumina)全外显子测序（WES）目前三十二页\总数六十六页\编于十九点癌症相关（人）遗传性疾病（人）其它非传染性疾病（人）主要用于寻找罕见突变，遗传性突变及癌症相关的体细胞突变可以做SNP，InDel分析，但由于捕获区域较短，一般不用于CNV，SV分析。WES应用领域目前三十三页\总数六十六页\编于十九点成本低（一般50-150X，也仅需要8-15G数据）降低分析背景，容易发现稀有突变。大约能测到50-80bp的片段缺失，由于外显子捕获芯片片段较短，很难判断是由捕获脱靶导致还是由缺失导致。同样因为捕获芯片片段较短，一般不做CNV，SV分析。WES特点目前三十四页\总数六十六页\编于十九点WES方案流程目前三十五页\总数六十六页\编于十九点包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等。可以高通量分析转录本信息，发现未知的转录本和基因注释。寻找个体间，同一个体不同时期等感兴趣基因表达丰度变化。转录组测序(RNA-Seq)目前三十六页\总数六十六页\编于十九点mRNA-Seq方案目前三十七页\总数六十六页\编于十九点有关lncRNA的一些知识：长度大于200bp无法编码蛋白有内含子区和外显子区非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体结构的影响，对RNA加工修饰及稳定性的影响，对转录和翻译的影响，甚至对蛋白质的转运及稳定性都有一定的影响。所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对lncRNA的分析，并且发现了许多新的lncRNA。目前三十八页\总数六十六页\编于十九点lncRNA-Seq目前三十九页\总数六十六页\编于十九点sRNA-Seq目前四十页\总数六十六页\编于十九点RNA-seq的优势不局限于已知的基因组序列信息，适用于未知基因组序列的物种的高通量转录组研究相对于芯片技术，背景信号值低，没有检测上限，对于基因表达谱有非常宽的检测范围。在有内参的情况下，在定量方面显示出了较高的准确度和可重复性。不需要克隆的步骤，操作简单，需要的样本量少，可在单细胞的水平上进行表达谱分析通量高，成本比Tillingarray或者大规模的EST测序要低。目前四十一页\总数六十六页\编于十九点RNA-seq的挑战文库构建过程中大片段的RNA必须经过片段化处理，会引入一定的偏倚。PCR会造成表达量的变化。海量短序列数据的比对或拼接情况复杂，对重复序列和多匹配序列的精确定位存在明显问题。高等真核生物可变剪接和反式剪接的鉴定仍有相当的误差。测序深度的确定因物种、器官、组织、时期而变，很难有统一公式直接计算。目前四十二页\总数六十六页\编于十九点石蜡包埋样本解决方案目前四十三页\总数六十六页\编于十九点FFPE样本(石蜡包埋切片组织)石蜡包埋技术（Formalin-FixedandParrffin-Embedded,FFPE）是现今临床上最常见的保存DNA方法，全球医院的珍贵临床样本中超过80%都使用该技术保存，但由于该技术DNA经过福尔马林浸泡，使DNA分子发生交联和酶修饰，导致DNA存在不同幅度的降解。目前四十四页\总数六十六页\编于十九点样本量巨大，80%以上的临床样本都使用石蜡包埋保存很多珍贵的临床样本已经做过组织学，病理学研究，很容易完成相关实验验证为何要使用FFPE样本目前四十五页\总数六十六页\编于十九点难于抽提，福尔马林处理后的DNA容易产生交联，使提取出的DNA量偏低提取出的DNA质量低，通常降解200bp-5kb降解程度与石蜡包埋的时间相关FFPE-WES的巨大挑战目前四十六页\总数六十六页\编于十九点目前四十七页\总数六十六页\编于十九点目前四十八页\总数六十六页\编于十九点是否有相同突变?目前四十九页\总数六十六页\编于十九点目前无法用于WGRS，样本降解严重，对DNA覆盖度有很大影响。DNA量过少，质量很差。石蜡包埋时间越长，福尔马林对DNA交联和损伤就越大。未使用保护缓冲液处理的福尔马林影响更大。FFPE样本仍存在问题目前五十页\总数六十六页\编于十九点CTCS和ctDNA目前五十一页\总数六十六页\编于十九点什么是CTCs？CTCs(CirculatingTumorCells)自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞.CTCs是肿瘤转移过程中在血液循环系统中存活的肿瘤细胞，它的生成被认为是肿瘤发生转移的必要前提。

目前五十二页\总数六十六页\编于十九点CTCs研究意义深入研究CTCs有助于对肿瘤转移机制进一步了解，为抗肿瘤转移的治疗提供新的依据

CTCs的检测有助于早期转移肿瘤患者的诊断、监测术后患者肿瘤的复发与转移有助于评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗策略

目前五十三页\总数六十六页\编于十九点CTCs研究难点CTCs并没有显著的特异性同其它血细胞明确区分且不同组织学类型和分子表型的肿瘤分别表达不同的标志物。CTCs在外周血中数量稀少，一般在106-107个白细胞中仅含有1个。无显著特异性数量少目前五十四页\总数六十六页\编于十九点CTCs的富集非特异性富集方法

特异性富集方法

方法CTCs-芯片富集法

纳米粒富集法

免疫磁珠富集法

密度梯度离心富集法

细胞大小富集法

细胞变形性富集法

细胞电学特征富集法

Ficoll法和Oncoquick法上皮肿瘤细胞大小分离(ISET)和微滤芯片技术

双向电泳-场流分离法（DEP-FFF）磁性活细胞分选法(MACS)、AdnaTest法、Cellsearch法目前五十五页\总数六十六页\编于十九点通过细胞形态富集目前五十六页\总数六十六页\编于十九点微流芯片目前五十七页\总数六十六页\编于十九点密度梯度离心Plasma:血浆Mononuclearcell：单核细胞（包括淋巴细胞、单核细胞、上皮细胞和肿瘤细胞）Ficoll：密度梯度液RBCs：红细胞

目前五十八页\总数六十六页\编于十九点免疫磁珠富集法目前五十九页\总数六十六页\编于十九点微流体目前六十页\总数六十六页\编于十九点CTCs鉴定流式细胞仪分析(flowcytometry

FCM)

免疫细胞化学技术ICC

（immunocytochemistry）

鉴定标本中细胞抗原性和形态学特征，能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力ICC是用能与显色剂结