抗原的表达和纯化

抗原的表达和纯化第1页，共26页，2023年，2月20日，星期一一、抗原组生产流程Ag组的操作流程菌种接种培养过夜扩大培养诱导继续培养收集菌体破碎菌体离心沉淀包涵体纯化步骤可溶性蛋白纯化步骤上清第2页，共26页，2023年，2月20日，星期一可溶蛋白具体生产步骤1、接种80ul菌种至100ml抗性培养基中，37度培养过夜。2、次日加入新鲜抗性培养基至600ml，培养1.5小时至活力最旺盛。3、加入0.5mM的IPTG诱导3.5小时4、收集菌体（66转/秒×15min),弃上清，加入PBST悬浮菌体，加入200ulMPMSF,100ulEDTA(his标签蛋白不加），冰浴下超声破碎细胞。5、摇床4度孵育1小时。6、高速离心，133转/秒×15min。取上清，加入600ulbeads结合过夜。7、收集beads（33转/秒、瞬时），洗涤液洗涤3次。加入300ul洗脱液，4℃振荡洗脱1小时，瞬时离心，取上清。再次加入300ul洗脱液，洗脱1小时，两次洗脱液合为一管。8、将所得的上清取10ul加入10ulsamplebuffer制样，SDS跑胶。9、根据maker的跑胶结果目测蛋白质量及浓度。第3页，共26页，2023年，2月20日，星期一二、实验原理基因的表达亲和层析纯化可溶蛋白包涵体的纯化原理SDS－PAGE电泳的基本原理第4页，共26页，2023年，2月20日，星期一三、基因的表达在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导。如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏

。原核生物的基因调控主要发生在转录水平上。原核生物的基因表达主要是负性调控，诱导物可用于去除阻遏作用。公司构建的基因工程菌采用乳糖操纵子调控系统。第5页，共26页，2023年，2月20日，星期一（一）乳糖操纵子(lacoperon)的结构调控区CAP结合位点启动序列操纵序列调节基因ZYAOPDNAI结构基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透性酶A：乙酰基转移酶第6页，共26页，2023年，2月20日，星期一（二）阻遏蛋白的负性调节mRNA阻遏蛋白阻遏基因IDNAZYAOP没有乳糖存在时pol第7页，共26页，2023年，2月20日，星期一有乳糖存在时IDNAZYAOPpol启动转录mRNA阻遏蛋白mRNA乳糖别乳糖β-半乳糖苷酶第8页，共26页，2023年，2月20日，星期一（三）CAP/CRP的正性调节CAP(cataboliteactivatorprotein,分解代谢物激活蛋白)涉及到正性调节.CAP又称为CRP(cAMPreceptorprotein),lacoperon高水平转录必需的一个激活蛋白。葡萄糖抑制cAMP的形成。葡萄糖存在时，cAMP浓度低；仅在葡萄糖消耗完毕时,cAMP浓度增高。第9页，共26页，2023年，2月20日，星期一++++转录无葡萄糖，cAMP浓度高时促进转录ZYAOPDNACAPcAMPCAPcAMPCAPcAMPCAP结合位点第10页，共26页，2023年，2月20日，星期一lacI-系统中，不管是否存在乳糖，三种乳糖分解代谢有关的酶得到持续表达。lacI+系统中，当葡萄糖存在时，不表达三种酶；然而，当存在乳糖而又缺乏葡萄糖时，这三种酶得到表达。第11页，共26页，2023年，2月20日，星期一乳糖操纵子受到两种调节：阻遏蛋白的负调节和CAP的正调节，有两道控制开关，只有两道开关同时打开时,即只有在缺乏葡萄糖并存在乳糖时,基因才能够转录。mRNAZYAOPDNAImRNA阻遏蛋白乳糖别乳糖β-半乳糖苷酶CAPcAMPCAPcAMPpol启动转录CAPcAMP第12页，共26页，2023年，2月20日，星期一（四）乳糖操纵子诱导物由于乳糖虽可诱导酶的合成，但易被β-半乳糖苷酶催化降解，并且产生很多复杂的动力学问题，因此人们常用安慰诱导物诱导。乳糖操纵子的安慰诱导物除了异丙基巯基半乳糖（IPTG)，还可以是巯基半乳糖苷（TMG）、O-硝基半乳糖苷（ONPG)。IPTG为常用的诱导物，是一种十分有效的乳糖操纵子的诱导剂,可与阻遏物结合促进基因的表达。IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被运送，不被大肠杆菌所分解所以浓度并不改变第13页，共26页，2023年，2月20日，星期一（五）影响蛋白表达的因素IPTG浓度：0.1-1mM0.5mM诱导温度:28℃37℃诱导时间:3.5h第14页，共26页，2023年，2月20日，星期一四、亲和层析纯化可溶性蛋白目前我们公司生产的抗原绝大部分是谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白和6XHISTag融合蛋白。融合蛋白的优点有：(1)表达效率高；(2)产生的融合蛋白比天然蛋白更稳定，融合蛋白是避免细菌蛋白酶降解的最好措施；(3)产生的蛋白质易于鉴定，纯化。GST-tag序列可以增加融合蛋白的溶解性。His-tag表达方便而且基本不影响蛋白的活性第15页，共26页，2023年，2月20日，星期一亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的蛋白的一类特殊层析技术。（一）亲和层析技术原理第16页，共26页，2023年，2月20日，星期一通常两个分子间特异亲和力的形成有两种情况：（1）两个分子之间，其构形有如积木般的互补，因为范德华力的关系，产生特异亲和力（2）两分子之间，因为某些基团间产生了二级键，造成了吸引力。亲和层析法按亲和配基的亲和力大小可分为两类（1）特异性配基亲和层析法，其配基，包括生物素、激素、抗原等，KD值为10-7～10-15。

（2）通用性配基亲和层析法，其配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金属离子等，KD值为10-4～10-6。（二）亲和层析法分类第17页，共26页，2023年，2月20日，星期一利用了GST与GSH间酶与底物构象互补的特异性结合特性，将带标签的蛋白与其他蛋白分离开。其结合力是范德华力，结合力弱且需较长的结合时间，但特异性高。GSTfusionprotein的洗脱原理是通过调节GSH浓度及洗脱时间将目的蛋白洗脱下来,洗脱液中的还原型GSH与beads上的谷胱甘肽竞争结合融合蛋白，从而将目标蛋白洗脱。

（三）GSTfusionprotein的纯化

——特异性配基亲和层析法第18页，共26页，2023年，2月20日，星期一此图为Glutathionesepharose的终端结构，谷胱甘肽通过SH基团与sepharose基质的环氧乙烷基团通过环氧激活特异偶联到sepharose上。此图为凝胶上的手臂谷胱甘肽与GST-tag融合蛋白结合后结构，中间红色的部分既为谷胱甘肽。第19页，共26页，2023年，2月20日，星期一GST亲和纯化中常见的问题1SymptomsPossibleCausesComments结合在beads上的目的蛋白过少细胞裂解效果不好延长破碎时间，加大破碎率表达的目的蛋白不溶通过抑制包涵体的形成来增加目的蛋白的可溶性目的蛋白自身的降解细胞破碎后：加大蛋白酶抑制剂；操作过程保持低温，动作柔和，轻拿轻放。目的蛋白与beads结合时，pH值没调好GSTfusionprotein与beads的结合对pH值是相当敏感的pH>8.0对结合不利。一般bindingbufferpH=7.4蛋白结合后过度的洗涤为避免将一些结合不牢固的目的蛋白洗下来，要限制洗涤次数第20页，共26页，2023年，2月20日，星期一GST亲和纯化中常见的问题2SymptomsPossibleCausesComments目的蛋白的洗脱效果不好目的蛋白分子量太大蛋白越大，洗脱效率越低。1.适当提高洗脱液中GSH的浓度；2.提高洗脱液的盐离子浓度（Nacl:100-500mM）；3.调节洗脱液的pH值，pH>8.0洗脱效率大于pH=7.4；4.加大洗脱体积，延长洗脱时间SDS检测后，发现杂带多目的蛋白降解可1.使用较温和的破碎条件；2.保持低温；3.避免破碎时蛋白产生气泡；4.加入还原剂如10mMDTT于裂解液中。杂蛋白的共纯化可1.增加洗涤次数；2.提高bindingbuffer盐离子浓度（Nacl:500mM），可降低一些因为离子作用带来的非特异性吸附；3.延长破碎后蛋白的孵育时间及133转离心时间；4.缩短蛋白与beadsbinding时间第21页，共26页，2023年，2月20日，星期一（四）6XHISTag蛋白的纯化

——特异性配基亲和层析法蛋白质表面的一些氨基酸，例如组氨酸等能够与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+发生特殊的相互作用。因此偶联了合适金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。beads与6xHisfusionprotein间产生了共价键，结合力强但特异性差。组氨酸残基的五元咪唑环是蛋白与Ni离子作用的关键。第22页，共26页，2023年，2月20日，星期一6xHisfusionprotein的洗脱原理是通过高浓度的咪唑洗脱目的蛋白，洗脱液中的咪唑通过和金属离子结合而高效地替换掉His标签融合蛋白。由于一些宿主细胞蛋白上也含有组氨酸，可以结合在beads上，洗脱时也会被洗脱下来（特异性差的原因）。因此在洗涤液中加入低浓度咪唑，可以避免宿主细胞蛋白的结合。第23页，共26页，2023年，2月20日，星期一HIS标签蛋白亲和纯化中常见的问题1SymptomsPossibleCausescomments目的蛋白无法与beads结合蛋白降解1.加大蛋白酶抑制剂；2.操作过程保持低温，动作柔和，轻拿轻放。bindingbufferpH有错误调整pH=7.5蛋白盐离子浓度太大结合前，稀释蛋白溶液目的蛋白His-tag隐藏目的蛋白水溶性差，自身折叠将His-tag包裹隐藏起来。可尝试在变性的条件下与beads结合，确保beads工作良好的前提下，调整一下beads结合的pH值；延长样品与beads结合的时间一些表达量很大的杂蛋白吸附于beads上，使目的蛋白无法吸附在目的蛋白与beads结合时，向蛋白溶液内加入20mM咪唑减少非特异性吸附第24页，共26页，2023年，2月20日，星期一HIS标签蛋白亲和纯化中常见的问题2SymptomsPossibleCausesComments目的蛋白的洗脱效果不好目的蛋白本身带有一个金属离子结合域加大洗脱液中咪唑浓度SDS检测杂带多宿主菌表达了一些能与HisTag共同结合在beads上的杂蛋白原因：1.有些杂蛋白本身带有His残基，并暴露在蛋白的表面，2.金属螯合层析本身的特异性较弱，Ni离子不仅能与His残基中的咪唑环结合，