实验四微生物的菌落形态观察平板菌落计数及菌种保藏(张理珉)

目的要求1、观察细菌、放线菌、霉菌的菌落形态特征，并加以区分。2、掌握平板菌落计数的原则和方法。3、掌握三种类群微生物的单菌落挑取，并接种于斜面，进一步加强无菌操作技术。4、了解菌种保藏的原理、重要性及常见方法。目前一页\总数七十页\编于十七点实验内容微生物菌落形态观察及区分（细菌、放线菌、霉菌、酵母菌——放在后面介绍）平板菌落计数（细菌、放线菌、霉菌）挑取单菌落接种于斜面介绍菌种保藏的原理和方法目前二页\总数七十页\编于十七点对于一个样品，针对微生物来说最想了解的问题（首要问题）存在的微生物种类各类微生物的数量各类微生物的作用说明：

只是针对可人工培养的微生物来说，乐观估计可人工培养的部分只占总数的10%（保守估计只有1%）；证据来源有两方面——分子生物学的探索；和原位培养的比较。目前三页\总数七十页\编于十七点实验内容一

——微生物菌落形态观察及区分目前四页\总数七十页\编于十七点一、微生物的形态和菌落特征的比较表单细胞微生物菌丝状微生物细菌酵母菌放线菌霉菌主要特征菌落含水状态很湿或较湿较湿干燥或较干燥干燥外观形态小而突起或大而平坦大而突起小而紧密大而疏松或大而致密细胞相互关系单个分散或有一定排列方式单个分散或假丝状丝状交织，紧密丝状交织形态特征小而均匀，个别有芽孢大而分化细而均匀粗而分化参考特征菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明菌落与培养基结合程度不结合不结合牢固结合较牢因结合菌落颜色多样单调，一般呈乳脂或矿烛色，少数红色或黑色十分多样十分多样菌落正反面颜色的差别相同相同一般不同一般不同菌落边缘一般看不到细胞可见球状，卵圆状或假丝状细胞有时可见细丝状细胞可见粗丝状细胞细胞生长速度一般很快较快慢一般较快气味一般有臭味多带酒香味常有泥腥味或抗生素气味往往有霉味目前五页\总数七十页\编于十七点二、细菌菌落形态的多样性（示意图）目前六页\总数七十页\编于十七点目前七页\总数七十页\编于十七点目前八页\总数七十页\编于十七点目前九页\总数七十页\编于十七点目前十页\总数七十页\编于十七点目前十一页\总数七十页\编于十七点目前十二页\总数七十页\编于十七点延展性较强的一些霉菌菌丝（松散）目前十三页\总数七十页\编于十七点平板中菌落形态目前十四页\总数七十页\编于十七点三、菌落特征描写方法①大小大、中、小、针尖状。可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。②颜色黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。③干湿情况干燥、湿润、粘稠④形态圆形、不规则等⑤高度扁平、隆起、凹下⑥透明程度透明、半透明、不透明⑦边缘整齐、不整齐注意：可以进一步细分描述目前十五页\总数七十页\编于十七点菌落形态可因培养基成分不同而发生显著变化（枯草芽孢杆菌在营养缺乏时形成的雪花状菌落）目前十六页\总数七十页\编于十七点四、各类型菌落的总体特征

——反映细胞结构及特点细菌——含水量高（多，形成毛细管水），湿润，细腻（个体小）。

细菌菌落说明：光滑型——一般具有荚膜；表面粗糙、褶皱、折光性强（不透明）菌落——一般具有芽孢；菌落大而扁平——一般具有鞭毛。放线菌——菌落大小差别不大，相对较小，干燥（粉状），菌丝细（肉眼分不清楚）。霉菌——菌落较大，干燥（粉状，较粗，颗粒），丝状较粗（肉眼可以区分）。以最少的特征指标完成区分或分类最好。目前十七页\总数七十页\编于十七点细菌的培养特征包括（群体形态特征）：①各种固体培养基上的形态（针对菌落）②各种液体培养基上的表现形态③各种斜面培养基上的表现形态（针对菌苔）④各种半固体培养基上的形态（穿刺培养）⑤其它注意：微生物菌落形态的区分除了通过肉眼进行区分判断外，还可以借助其它工具进行直接接触区分判断（牙签、接种工具等）目前十八页\总数七十页\编于十七点细菌菌落扫描电镜显微照片目前十九页\总数七十页\编于十七点实验内容二

——从分离平板上挑取单菌落目前二十页\总数七十页\编于十七点挑取细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上——接种环挑取放线菌单菌落接种于高氏1号培养基斜面上——接种环、接种钩挑取霉菌单菌落接种于马丁氏培养基斜面上——接种环、接种钩目前二十一页\总数七十页\编于十七点一般流程图（无菌操作）：

拿起平板并打开→用接种工具挑取单菌落→放于酒精灯外焰旁（不得过近？）→放下平板拿起斜面并取下塞子→用已粘有菌体的接种工具在斜面上划“之”字线或直线→接种工具取出、灼烧→塞好胶塞→作标记（菌种名称、接种人、接种日期等）。目前二十二页\总数七十页\编于十七点接种斜面的演示图操作要点：①始终保持无菌操作；②棉塞或硅胶塞不放于桌面，只能夹于拿接种工具的手中（小手指和手掌中间或无名指和小手指中间）；③一般在斜面培养基上以“之”线划接种（充分利用斜面，得到最大量的菌体）；④有时也进行直线接种划线（斜面培养特征观察）目前二十三页\总数七十页\编于十七点目前二十四页\总数七十页\编于十七点说明：注意试管斜面的拿法（手掌向上，斜面向上），与接种工具的配合使用；记号笔标记时，过火烤一下，字不容易掉；挑取单菌落于相应斜面，管口标记学号，橡皮筋捆扎（三支）；三支斜面的接种情况作为一次考核，记入平时成绩。目前二十五页\总数七十页\编于十七点实验内容三

——平板菌落计数目前二十六页\总数七十页\编于十七点一、相关知识介绍1、微生物增殖和样品微生物数量的计量平板菌落计数

使单细胞形成菌落，一个单菌落代表一个单细胞，从而反映出微生物的数量。（1）利用计数器在显微镜下直接计数（以后介绍）；（2）最大或然数（Mostprobablenumber，MPN，又称稀释培养测数法、最大可能数）；

适用具有特殊生理功能的类群——存在但不能人工培养形成单菌落，可以利用生化手段检测出；利用统计学原理计算，结果粗放，只能得到数量级（近似数）。目前二十七页\总数七十页\编于十七点（3）菌体浊度的测定（只针对单细胞微生物）；

利用分光光度计在600nm测定吸光度值。（4）细胞干重和湿重的测定（有时湿重以体积计量）；（5）各种细胞物质含量的测定（蛋白质、核酸、ATP、磷、叶绿素等定量测定）——建立了多种快速检测方法；说明：后两种对丝状菌比较有意义。目前二十八页\总数七十页\编于十七点2、常见微生物检测项目（1）常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数（2）致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O-157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等目前二十九页\总数七十页\编于十七点3、快速检测方法的现状国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色培养基法在国外应用相当成功。国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术。从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测的一大方向（？）。目前三十页\总数七十页\编于十七点4、常规微生物快速检测技术现状传统计数改良法：（1）螺旋平板计数法：螺旋接种仪＋菌落计数仪（2）滤膜法：常用于一些可过滤样品的检测。（3）纸片法：培养基固体在载体上。省去制做培养基的时间。主要用于细菌总数检测。（4）其它：如Simplate即用胶，改良MPN产品。目前三十一页\总数七十页\编于十七点螺旋平板法DWS螺旋平板接种仪aColyte自动菌落计数仪目前三十二页\总数七十页\编于十七点螺旋平板原理平皿旋转接种针往外移动同时自动将样品稀释1000倍。目前三十三页\总数七十页\编于十七点快速检测微生物数量的新方法：（1）ATP法（2）电化学法（3）颜色变化（4）流式细胞技术及激光扫描技术（5）其它：热量法，放射测量法说明：检测方法建立的基础——可测、稳定、重现、可行、简便目前三十四页\总数七十页\编于十七点浊度与微生物生物量测定原理：①细胞的存在会造成光的散射，降低光线的透过；②在一定范围内细胞浓度与吸光度成正比目前三十五页\总数七十页\编于十七点二、平板菌落计数的优缺点优点：反映的是微生物活菌数量，可获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。缺点：操作较繁，所需时间较长，测定结果易受多种因素的影响。目前三十六页\总数七十页\编于十七点三、平板菌落计数的表述及计算因为微生物不易完全分散成单个细胞；菌落的来源也并非完全为单个细胞；因此其测定结果比实际菌数偏低；引入菌落形成单位（colony-formingunits，cfu）来表示，而不以绝对菌体数量来表示样品的活菌含量。计算公式：计算公式说明：①如样品来源为液体其表示为CFU/ml；②所加样品量为每个平板所加入的相应稀释液的体积（ml）。目前三十七页\总数七十页\编于十七点四、菌落计数原则（六条）

1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。目前三十八页\总数七十页\编于十七点

2、首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总数（见下表，例1）。

3、若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中稀释度(倍数)较小的计算菌落总数（见下表，例2及例3）。

目前三十九页\总数七十页\编于十七点

4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例4）。

5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例5）。

6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表，例6）。目前四十页\总数七十页\编于十七点计算菌落总数方法举例（加样量为1mL）例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数（个／mL）备注10-110-210-3１136516420－1.64×104一般采用科学计数法；取两位小数；“无法计数”和“0”在这里是两个概念——前者是指因稀释倍数掌握不好或其它原因造成不能计数，后者指平板上无微生物菌落生长。２2760295461.63.78×104３2890271602.22.71×104４无法计数1650513－5.13×105５27115－2.70×102６无法计数30512－3.05×104目前四十一页\总数七十页\编于十七点针对计数原则的说明1、比较时要换算至同一个稀释度进行；2、霉菌可能难以完全遵循此六项计数原则，菌落大，漫延性强，30~300个/皿时，菌落过密重叠而无法计数。3、牛肉膏培养基：只计细菌的数量高氏1号培养基：只计放线菌的数量马丁氏培养基：只计霉菌的数量目前四十二页\总数七十页\编于十七点目前四十三页\总数七十页\编于十七点目前四十四页\总数七十页\编于十七点目前四十五页\总数七十页\编于十七点五、平板菌落计数结果的统计表细菌稀释度10-310-410-5123平均123平均123平均cfu数/平板每毫升中的cfu数放线菌稀释度10-210-310-4123平均123平均123平均cfu数/平板每毫升中的cfu数霉菌稀释度10-210-310-4123平均123平均123平均cfu数/平板每毫升中的cfu数目前四十六页\总数七十页\编于十七点实验内容四

——介绍菌种保藏的原理和方法目前四十七页\总数七十页\编于十七点一、菌种保藏的重要性微生物基本特性所决定的——微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快、易变异、易污染。研究工作的连续性需要。工业及科研菌种要注意菌种的衰退和复壮。目前四十八页\总数七十页\编于十七点二、菌种的衰退

菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。

纯菌种自发突变突变个体传代增殖原始个体不纯菌种衰退菌种目前四十九页\总数七十页\编于十七点三、菌种衰退的现象菌落和细胞形态改变生长速度缓慢，产孢子越来越少代谢产物生产能力下降，即出现负突变致病菌对宿主侵染能力下降对外界不良条件的抵抗能力下降等目前五十页\总数七十页\编于十七点四、菌种衰退的原因

基因突变－－主要原因1、有关基因发生负突变导致菌种衰退

2、表型延迟造成菌种衰退

3、质粒脱落导致菌种衰退

连续传代－－加速衰退

不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退目前五十一页\总数七十页\编于十七点五、菌种衰退的防止

控制传代次数创造良好的培养条件利用不易衰退的细胞移种传代采用有效的菌种保藏方法讲究菌种选育技术定期进行分离纯化，测试性能目前五十二页\总数七十页\编于十七点六、菌种的复壮

狭义的复壮－－消极的措施是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮－－积极的措施是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。目前五十三页\总数七十页\编于十七点七、菌种复壮的主要方法1、纯种分离法通过纯种分离，可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状。菌落纯（“菌种纯”）细胞纯（“菌株纯”）目前五十四页\总数七十页\编于十七点

2、宿主体内复壮法对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。

3、淘汰法将衰退菌种进行一定的处理（如药物、低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。

4、遗传育种法把退化的菌种重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。目前五十五页\总数七十页\编于十七点八、菌种保藏达到的目的1、存活，不丢失，不污染；2、防止优良性状丢失；3、随时为生产、科研提供优良菌种。目前五十六页\总数七十页\编于十七点九、菌种保藏的基本原则

使微生物的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态目前五十七页\总数七十页\编于十七点十、常采取的措施1、低温——4℃、-20℃、-70℃、-196℃2、干燥——降低水活度（aw）3、缺（绝）氧——针对专性好氧菌4、低营养状态5、高渗透压——防腐（针对食品等）目前五十八页\总数七十页\编于十七点十一、常见的方法传代培养法

一般斜面培养基4℃保存、在培养物表面覆盖无菌石蜡油（1cm以上）悬液法（蒸馏水、缓冲液）

对乳酸菌、酵母菌等有一定作用和效果载体法（砂土、滤纸片等）

针对微生物所产的孢子保存较好，所以抗生素生产菌种常用真空干燥法（冷冻真空干燥法、L-干燥法）

对不产孢子的丝状真菌营养体保存效果不好，不宜采用冷冻法（-20℃、-70℃、-196℃，保护剂）

温度越低效果越好，液氮适用于所有生物材料的保存目前五十九页\总数七十页\编于十七点保护剂的选择作用——可以使细胞经低温冷冻时减少冰晶的形成，从而避免冰晶的机械损伤（玻璃化）。真空冷冻干燥法——脱脂牛奶、多种糖类溶液、蛋白及多肽溶液等冷冻法——甘油溶液（10~40%）；二甲亚砜、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等脱脂牛奶的制备：

鲜牛奶煮沸→冰箱静止过液→吸取底部牛奶（虹吸）鲜牛奶煮沸→离心除脂（表层乳脂）目前六十页\总数七十页\编于十七点几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）低温各大类3~6月简便冰箱保藏法（半固体）低温、局部缺氧细菌、酵母菌6~12月简便石蜡油封藏法低温、缺氧各大类1~2年简便沙土保藏法干燥、缺氧、低营养产孢子微生物1~10年简便有效冷冻真空干燥法干燥、无氧、低温、有保护剂各大类（不产孢丝状真菌除外）5~15年以上简便有效冷冻法（-196℃）低温、有保护剂各大类（包括各类细胞）15年以上适应最广目前六十一页\总数七十页\编于十七点十二、菌种保藏的补充说明菌种保藏不是要求所有保存菌种都保持存活，而是在加入大量菌体经保藏处理后还有少量存活；保藏可以采用多种措施联合共同完成。针对专性寄生生物体还有一类宿主保藏法（下面介绍）目前六十二页\总数七十页\编于十七点宿主保藏法（针对专性寄生生命体）此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。目前六十三页\总数七十页\编于十七点十三、国内外菌种保藏机构国内外都有专门的保藏机构和制度其任务——广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)

美国的典型菌种保藏中心(ATCC)

英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）目前六十四页\总数七十页\编于十七点中国微生物菌种保藏机构名称和缩写

缩写名称缩写名称ACCC中国农业微生物菌种保藏管理中心ISF中国农业科学院土壤肥料研究所SH上海市农业科学院食用菌研究所CACC抗菌素菌种保藏管理中心IA中国医学科学院抗菌素研究所SIA四川抗菌素工业研究所CCGMC普通微生物菌种保藏管理中心AS中国科学院微生物研究所AS-IV中国科学院武汉病毒研究所CFCC林业微生物菌种保藏管理中心CAF中国林业科学院菌种保藏管理中心CICC工业微生物菌种保藏管理中心IFFI轻工业部食品发酵工业科学研究所CMCC医学微生物菌种保藏管理中心ID中国医学科学院皮肤病研究所NICPB卫生部药品生物制品监察所IV中国医学科学院病毒研究所CVCC兽医微生物菌种保藏管理中心CIVBP中国兽医药品监察所YM云南省微生物研究所目前六十五页\总数七十页\编于十七点国际微生物菌种保藏机构名称和缩写

缩写名称简要介绍ATCCAmericanTypeCultureCollection美国典型菌种保藏中心，美国马里兰州，罗克维尔市ATCC主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。

该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。

另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。NRRLAgriculturalResearchServiceCultureCollection美国农业研究菌种保藏中心是由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏方法、环境保护、分子生物学、食品安全、普通微生物、分类学的研究。

该中心保藏有细菌10500株，真菌45000株，酵母14500株，放线菌9500株。

另外，该中心还提供细菌、真菌、酵母的鉴定服务。CBSCentraalbureauvoorSchimmelcultures荷兰微生物菌种保藏中心，真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市CBS是半政府性质的主要保藏真菌、酵母菌种保藏中心。

该中心主要从事菌种保藏方法、分类学、分子生物学、医学微生物学等的研究。

该中心保藏有真菌35000株、酵母5500株。该中心保藏的菌种可出售。NBRCNITEBiologicalResourceCenter日本技术评价研究所生物资源中心，NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。

该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。该中心保藏的菌种可出售。目前六十六页\总数七十页\编于十七点国际微生物菌种保藏机构名称和缩写

缩写名称简要介绍KCTCKoreanCollectionforTypeCultures韩国典型菌种保藏中心，KCTC是由政府科学技术部门支持的半政府性质的菌种保藏中心。主要从事应用微生物、基因工程、工业微生物、菌种保藏、发酵、分子生物学、分类学等的研究。

该中心保藏有细菌5005株，真菌178株，酵母225株，质粒51株，动物细胞98株，动物杂合细胞21株，植物细胞31株。该中心保藏的菌种可出售。DSMZDe