质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用

质谱技术在微生物鉴定和

生物医学中的应用306医院检验科易勇2016.03

AssuranceConfidencePerformanceResonance岛津（梅里埃）MALDITOF产品系列

LinearonlyMALDI-TOF

Linearand reflectronMALDI-TOFPSDcapability

Linearand reflectronMALDI-TOF/TOFPSD&CID capability

Unique instrumentMALDI-iontrap-TOFreflectrononlyMSncapabilityHighresolutionand highmassaccuracy布鲁克各类现代生物质谱：离子阱MALDITOF/TOFESI-Q-TOFFTMS质谱仪的工作原理

质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷z有关，即m/z=2U/v2

其中z为离子的电荷，U为加速电压，m为离子的质量，v为离子初加速后的运动速度。具有速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。电离源质谱仪中产生离子的装置称为离子源(ionsource)。电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法。

质谱技术中的几种离子源基质辅助激光解吸离子化

(MatrixAssistedLaserDesorptionIonization，MALDI)2.电喷雾离子化(Electrosprayionization，ESI)SampletargetIonopticsLineardetectorLaserMALDI-TOFMALDI:线性工作原理Mixmatrix&sampleontargetFirelaseratmatrix/sampleIonizesample(solidtogasphase)Accelerate/extractionsSeparateionsinanalyzerRecordspectrumatdetectorTimeofflight(TOF)massanalyzer(fieldfree)02040608010010000200003000040000m/z+vemode[M+H]+ionsMALDI基质辅助激光解析附原理:

Streptococcuspneumoniae:masssignalsmatchingtoribosomalproteins(consideringpossiblemethioninecleavageand/ormethylation)aremarkedinred~50%ofpeaksunambiguouslyrepresentribosomalproteinsproteinmassesobtainedfromtheSwiss-Prot/TrEMBLsequencedatabase质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用质谱仪的基本结构一、真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态(离子源真空度应达1.3×10-4-3×10-5pa，质量分析器中应达1.3×10-6pa)。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、副反应过多，从而使图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等问题。一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。图5.1质谱仪的构成微生物鉴定方法感官视觉,嗅觉,味觉免疫单或多克隆抗体分子PCR……生化代谢能力和耐抗生素耗时气质法（GC-MS）脂肪酸，小分子糖MALDI-TOFMS质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用28/04/202310微生物鉴定新方法（MALDITOF）比现有方法鉴定更多生物多样性的病原体分析时间仅1-2minutes质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用现代微生物分类学:蛋白组学&基因组学

ProteinBacterialCellDNAGenomeProteomeDNAFingerprintMassFingerprintSpeciesDefinition&DeterminationMALDI-TOFMS质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用1212

不同细菌代表性指纹图谱不同

各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！1313肠杆菌（Enterobacteriaceae）MS图谱示:

科,属,种特异性峰值部分峰值是多数菌种共有的（如m/z4365:核糖体蛋白L36)峰值有

科,属,种或

亚种-特异性种间特异性代表峰值用来区分不同菌种核糖体蛋白不受生长条件影响MassspectraofProteusmirabilisDSM4479atdifferentincubationtimesNomajorqualitativechangesinpeakpatternsdistinguishingfamily,genusandspeciesDecreaseofsignalintensityovertimePresenceandabsenceofpeaksIdentificationwith>99%confidence质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用样品SARAMIS工作流程转移细胞到MALDI靶板导入数据至SARAMISLIMS鉴定/比较分析基质质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用微生物鉴定流程生长在固体培养基上的菌落全细胞MALDI-TOF谱图数据库中参考谱图输出可信鉴定结果找到匹配度最可信的谱图质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用17鉴定结果界面样品名称鉴定结果置信度MS数据日期只需数秒，全自动添加新采集数据至鉴定结果界面！科属种型数据数量不同颜色代表不同置信水平

深绿:99.9%

浅绿:90-99.9%黄色:85-90%

白色:70-85%低于70%不显示置信值红色:提醒复杂的结果匹配2种或以上菌种，置信度>99%:鉴定混合菌SARAMIS鉴定混合菌种AmassspectrumofamixedsamplecontainingPseudomonasaeruginosaandAchromobacterxylosoxidansShowspeaksspecific

tobothspecies300040005000600070008000900010000110001200013000Mass/Charge7291.64331.87319.65237.04973.76320.26692.27575.06618.34433.77097.78562.09086.06345.86045.05735.69402.710029.95209.06674.27487.87201.05014.67763.48880.73161.14700.96306.03787.23645.04543.14353.03344.55266.48745.86714.75676.09588.68403.99959.910123.29427.912565.810534.69215.88584.69724.211401.7质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用

单核增生性李斯特菌Listeriamonocytogenes(Lm)

兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，自然界分布广泛，是食源性李斯特病（人畜共患病）的致病原因，低温仍具有增殖能力对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是

20-30%该菌经常存在于速食食品中Ex.About2,500cases/yearinUSA食品安全

TokyoMarineUniversity,ProfKimuraandDr.TakahashiEatablewithoutheatedandcockedorcockedfood,ex.,ham,dailyproduct,salad,smokedfoodetc现有检测方法需要2步骤和选择培养基，耗时6天质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用Yakult(养乐多)乳酸菌生产质量控制品种改良Performance+SARAMIS质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用Classifiedasgenus=>species=>strain“Thickness”ofdatabaseisimportant.From2011Europeansocietyofclinicalmicrobiologyandinfectionsdisease菌种鉴定准确度质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用28/04/202322SARAMIS：SpectralARchiveAndMicrobial

IdentificationSystem数据库含有超级谱图（SuperSpectra）和参考谱图（ReferenceSpectra）使用者可以创建和储存超级谱图或参考谱图软件包可实现谱图的存储，分析和比较使用者可以做聚类分析，创建系统树图用于菌株分型质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用SARAMIS菌种特异峰型合成谱图包含所有在个体谱图中出现频率大于阀值的所有峰(如：在各谱图中出现70%的)在超级谱图中，所有峰值根据他们对所代表的菌种特异性而赋予权重值具有科、属特异性的峰值权重低，这些峰值不支持菌种鉴定具有菌种特异性的峰值权重则会加重质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用SARAMIS–比较工具300040005000600070008000900010000110001200013000m/z5263777496388176879299706009481767464086754583398962102194469678837715709788831426260ClusteranalysisofselectedreferenceandsamplemassspectraComparisontomassspectralpatternsofreferencespectrainthedatabase质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图谱，基因组学，表型数据）atypicalreferenceisolatesareover-representedinSARAMISphylogeneticdistancephylogeneticdistancefrequencyfrequency自然界菌种多样性质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用SARAMISSuperSpectraDatabase1.Unambiguousidentificationwith80+%confidenceLIMSSARAMISReferenceSpectraDatabase2.Identification<80%confidenceornoidentificationbySSp:ExaminationofsignificantmatchesandreleaseLIMS

SARAMIS与LIMS系统

质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用CulturefromthestockingricelolCultureinvariousconditionsCollectisolatesfromourlabandotherfacilities(10)MeasureMSspectraandconstructDatabaseApplytouncertainty,whichreducestabilityofidentification

Differenceincolonyinasamemedia2 HWproducttolerance3system Operator12people Culturemediamaximum5kinds Culturelength24,48,72h Culturevender3vendersMax3,240spectra深度透视数据库质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用MicroIDsystemintrucductionVersion1.0SampleTransferofcellstoMALDItargetExportdatatoMicroIDLIMSIdentification/ComparisonAnalysisMatrix自动鉴定界面比对鉴定界面MicroIDMALDI-TOFMS微生物鉴定优势一种对所有微生物都适用的方法无需预选测试与现代分类学结果一致高度配合有特殊需求使用者可扩展新菌种及其应用非常耐用且重复性高样品准备过程非常简化可进行高通量分析绝佳成本与效益比质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用32AXIMAMALDI:线性&反射

不只是微生物鉴定质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用MALDITOF全面解决方案质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用布鲁克各类现代生物质谱：离子阱MALDITOF/TOFESI-Q-TOFFTMS质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用高分辨质谱仪全方位应用

天然产物分析 药物研究 蛋白质组学 代谢组学 ............质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用micrOTOFQDryGasHeaterOrthogonalAcceleratorGlassCapillaryCollisionGasSupplyHexapole电喷雾离子源去溶剂系统飞行管检测器反射镜离子聚焦系统四级杆Q碰撞池质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用micrOTOFQDryGasHeaterOrthogonalAcceleratorGlassCapillaryCollisionGasSupplyHexapole电喷雾离子源去溶剂系统飞行管检测器反射镜离子聚焦系统离子漏斗式传输四级杆Q碰撞池质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用布鲁克公司独家专利设计： 离子漏斗式传输系统离子流方向>>>离子传输率大大提高，从而提高灵敏度。增宽传输离子质量范围

离子流方向>>>传统的锥式离子传输质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用micrOTOFQ适用范围：电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪分子式测定和分子结构鉴定：如：化学合成产品，配位化合物，天然产物，代谢物，残留农药等大分子研究如：蛋白质/多肽，多糖，多聚物等复杂混合物分析质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息MS/MS提供结构信息电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪SigmaFit™参数（同位素峰形匹配）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用精确质量(<3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息MS/MS提供结构信息电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪SigmaFit™参数（同位素峰形匹配）质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用

C254H383N65O75S6,5735.65

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模拟同位素分布峰形SigmaFit™参数——同位素峰形的匹配质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用

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模拟同位素分布峰形实测同位素分布峰形SigmaFit™参数——同位素峰形的匹配SigmaFit参数=0SigmaFit参数>>0质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用437.0425438.0372439.0397440.03690.00.40.81.2437.0427438.0376439.0400440.03590.00.40.81.2437.0396438.0351439.03750.00.40.81.2436.0398Experimental436.0400C12H22NO10S3436.0367C15H18NO10S2024602460246435436437438439440441442m/zsigma=0.0167sigma=0.0231Intensityx104ABC鉴定化合物的有效工具--SigmaFit

两种可能元素组成的确定质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用分子量>500Da未知物的元素组成预测？质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用人参提取液

（稀释倍数1:100;HPLC-microTOFQ）0510152025Time[min]02464x10Intens.BPC499.997-1299.991-AllMS1153.598181154.600531155.601441156.598420.000.250.500.751.001.251.504x10Intens.115411561158m/z质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用当设置误差范围<5ppm时：171个可能的分子式GenerateMolecularFormula质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用16个可能的分子式当设置误差范围<3ppm时：GenerateMolecularFormula质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用C55H93O25用SigmaTM参数比较同位素峰形匹配，选择Sigma值最小的分子式，即该化合物的分子式为：GenerateMolecularFormula质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用SigmaTM参数用于比较同位素峰形匹配1153.601141154.604561155.607421156.61021C55H93O25,1153.601153.595271154.598681155.601701156.60459C62H89O20,1153.5905001000150020002500Intens.050010001500200025001153115411551156115711581159m/zC55H93O25C62H89O20SigmaTM=0.0171SigmaTM=0.0540质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用未知多肽测序测定

GluFib:MS/MSofm/z=785.8(+2)333.1898480.2559684.3445813.3868942.42871056.47041171.49911285.5426N+0.0006D+0.0017N-0.0012E-0.0007E-0.0003G-0.0001F-0.0012F-0.0023SA-0.0007V+0.0014G-0.0014+MS,2.8-3.4min#(85-103)024684x10Intens.200400600800100012001400m/zMassDistanceRMS误差:

0.00097Da质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用——动态范围的实际意义