基因工程工具酶

基因工程工具酶第1页，共86页，2023年，2月20日，星期一基因工程的工具酶（instrumentalenzymeofgeneengineering）是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取重组体DNA制备等程序中所需要的酶类。第2页，共86页，2023年，2月20日，星期一基因工程常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。第3页，共86页，2023年，2月20日，星期一第一节限制性内切酶（Restrictionendonuclease）第4页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第5页，共86页，2023年，2月20日，星期一限制性内切酶(restrictionendonuclease)是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。第6页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第7页，共86页，2023年，2月20日，星期一1．限制与修饰系统上世纪50年代发现类似于人体的免疫系统，限制与修饰系统是细菌排除异物保护自身的防御机制：限制——酶切外源DNA修饰——甲基化自身的内切酶识别位点第8页，共86页，2023年，2月20日，星期一

噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。E.coli菌株λ噬菌体感染率KBCE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111K和B菌株中存在一种限制系统，可排除外来的DNA。而C菌株不能限制来自K和B菌株的DNA。第9页，共86页，2023年，2月20日，星期一2．限制酶的发现WernerArber于1962-1968年发现限制与修饰体系，1968年分离得到I型限制酶。1970年，H.Smith首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindⅡ限制酶。1971年，D.Nathans用HindII绘制了猿猴病毒SV40的限制酶谱。

第10页，共86页，2023年，2月20日，星期一到1986年下半年，发现615种限制酶和98种甲基化酶。到2006年2月，共发现4583种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3773种，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有68、3692、10种。第11页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第12页，共86页，2023年，2月20日，星期一限制酶的生物学功能是保护宿主不受外来DNA的感染，降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。与限制酶伴生的修饰酶多是甲基转移酶或甲基化酶，能保护自身的DNA不被降解。它们与对应的限制酶识别相同的序列，但其作用不是切割DNA，而是在两条链上对某个碱基进行甲基化。限制酶与甲基转移酶组成限制与修饰系统。第13页，共86页，2023年，2月20日，星期一根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为三类。ⅡⅠⅢ酶分子内切酶与甲基化酶

分子不在一起三亚基双功能酶二亚基双功能酶识别位点4-6bp,大多数为回文对称结构二分非对称5-7bp非对称切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外1000bp在识别位点下游24-26bp限制反应与甲基化反应分开的反应互斥同时竞争限制作用是否需用ATPNoYesYes第14页，共86页，2023年，2月20日，星期一在三个限制与修饰系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。

Ⅱ型在限制与修饰系统所占的比例达到93%。它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3’-羟基和5’-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。识别序列一般为4-6bp，切割位置因酶而异。第15页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第16页，共86页，2023年，2月20日，星期一限制性内切酶的命名由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.

influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶EcoRI—Escherichiacoli

RI

第17页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第18页，共86页，2023年，2月20日，星期一

1.识别顺序和酶切位点（1）限制酶识别序列的长度限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。识别序列的长度一般为4～8个碱基，最常见的为6个碱基。切割频率理论上为1/4n（n为识别序列长度），实际上与序列有关。第19页，共86页，2023年，2月20日，星期一（2）限制酶识别序列的结构限制酶识别序列大多具有回文对称结构

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’有些限制酶的识别序列不对称AccBSⅠCCG↓CTCGGC↑GAG第20页，共86页，2023年，2月20日，星期一有些限制酶可识别多种序列有些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。

AlwNⅠCAGNNNCTGGTCNNNGAC

AccⅠGTMKACCAKMTG第21页，共86页，2023年，2月20日，星期一（3）限制酶切割的位置限制酶对DNA的切割位置大多数在识别序列内部，但也有在外部的。第22页，共86页，2023年，2月20日，星期一2．末端种类（1）黏性末端（cohesiveend）识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。第23页，共86页，2023年，2月20日，星期一第24页，共86页，2023年，2月20日，星期一（2）平末端（Bluntend）在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端。如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）。第25页，共86页，2023年，2月20日，星期一（3）非对称突出端当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的。

BbvCⅠ

CCTCAGCGGAGTCGCCTCAGCGGAGTCG第26页，共86页，2023年，2月20日，星期一（4）同裂酶（isoschizomer）识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。同序同切同序异切同功多位识别序列有交叉第27页，共86页，2023年，2月20日，星期一（5）同尾酶许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的黏性突出末端，这些酶统称为同尾酶。这些酶切割DNA得到的产物可进行黏端连接。第28页，共86页，2023年，2月20日，星期一3.DNA末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。第29页，共86页，2023年，2月20日，星期一4.位点偏爱（Sitepreference）某些限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。λ噬菌体DNA全长48,502bp，有5个EcoRⅠ酶切位点。切割时并非在5个位点随机进行，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快10倍。第30页，共86页，2023年，2月20日，星期一造成位点偏爱现象的原因限制酶在切割DNA之前需要同时与两个识别位点作用；限制酶对要求作用的DNA序列有两个明显不同的结合位点，其中一个是为DNA切割时激活另一个的变构位点。第31页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第32页，共86页，2023年，2月20日，星期一对任意一个限制酶来说，都有其各自的最佳反应条件。缓冲液反应温度反应时间酶切反应的终止第33页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第34页，共86页，2023年，2月20日，星期一在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。实际上星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。第35页，共86页，2023年，2月20日，星期一引起星星活性的因素甘油浓度高（>5%）限制酶过量（>100U/l）离子强度低（<25mM）pH值过高（>8.0）反应体系含DMSO、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等有机溶剂Mg++

被其它二价阳离子如Mn++

、Cu++、Co++

或Zn++

代替第36页，共86页，2023年，2月20日，星期一抑制星星活性的措施减少酶的用量（可避免过分酶切）减少甘油浓度保证反应体系中无有机溶剂或乙醇提高离子强度到100～150mM（但不能抑制酶活性）降低反应pH至pH7.0保证使用Mg++作为二价阳离子第37页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、定义二、限制性内切酶的发现三、限制修饰系统的种类四、限制性内切酶的命名五、限制酶的特点六、酶切反应条件七、限制酶的星星活性（staractivity）八、限制酶的用途第38页，共86页，2023年，2月20日，星期一DNA重组限制酶（物理）图谱绘制突变分析（RFLP分析）限制酶的部分酶切与完全酶切第39页，共86页，2023年，2月20日，星期一第二节

甲基化酶（Methylase）第40页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、甲基化酶的种类与识别序列二、甲基化对限制酶切的影响第41页，共86页，2023年，2月20日，星期一原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。1.

限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。M.EcoRI

GA

mATTCC

EcoRI

GAATTC

不同

M．HpaI

C

mCGG

HpaI

CCGG

相同第42页，共86页，2023年，2月20日，星期一2.E.coli

的dam、dcm甲基化酶这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。GmATCDcm甲基化酶识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。C

mCAGGCmCTGG第43页，共86页，2023年，2月20日，星期一该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。3.哺乳动物的甲基化酶第44页，共86页，2023年，2月20日，星期一E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统

mcrA、mcrBC和mrr

，它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列，都降解由CpG甲基化酶（MSssⅠ）作用的DNA。4.E.coli中依赖于甲基化的限制修饰系统第45页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、甲基化酶的种类与识别序列二、甲基化对限制酶切的影响第46页，共86页，2023年，2月20日，星期一1．修饰酶切位点M.TaqⅠ处理DNA后，GTCGAC将不受HincⅡ切割。GTCGACGTCAACGTTGACGTTAACHincⅡM.TaqⅠ

TCGA第47页，共86页，2023年，2月20日，星期一2．产生新的酶切位点DpnⅠ是依赖甲基化的限制酶，TCGATCGA

受M.TaqⅠ处理后形成甲基化（A）产物TCG*ATCG*A

，其中

G*ATC

即为DpnⅠ位点。第48页，共86页，2023年，2月20日，星期一第三节

DNA聚合酶（DNApolymerase）第49页，共86页，2023年，2月20日，星期一DNA聚合酶指的是在DNA(或RNA)模板指导下，以4种dNTP为底物，在引物3’-OH末端聚合DNA链的一类酶。特点：①需模板(DNA或RNA)②需引物③聚合方向5′→3′④同时具有3′→5′和外切5′→3′外切作用第50页，共86页，2023年，2月20日，星期一目前已开发的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)(E.coli)Klenow片段(E.coli)T４DNA聚合酶T７DNA聚合酶TaqDNA聚合酶(耐热)DNA末端转移酶(小牛胸腺)反转录酶(依赖RNA)聚合酶依赖DNA的DNA聚合酶不依赖DNA的DNA聚合酶依赖RNA的DNA聚合酶第51页，共86页，2023年，2月20日，星期一

一.E.coliDNA聚合酶I（polI）PolI参与DNA修复，具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII参与DNA修复，具3’→5’外切酶活性polIII参与DNA复制，具3’→5’和5’→3’外切酶活性

1.E.coli

的DNA聚合酶系统第52页，共86页，2023年，2月20日，星期一

2.E.coliDNA聚合酶Ⅰ的活性5'--3'DNA聚合酶活性5'--3'外切核酸酶活性3’--5’外切酶活性交换反应第53页，共86页，2023年，2月20日，星期一3.E.coliDNA聚合酶Ⅰ的用途1）切口平移法制备探针Mg++DNaseⅠdNTPE.coliDNAPolⅠ第54页，共86页，2023年，2月20日，星期一2）用于cDNA克隆中的第二链，即单纯的DNA聚合活性。3）对3'突出端的DNA作末端标记Mg++,DNAPolI

[α-32PdATP]

AT第55页，共86页，2023年，2月20日，星期一二、KlenowDNA聚合酶KlenowDNA聚合酶是

E.coliDNApolⅠ经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5'--3'外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3'--5'外切活性不受影响。也称为Klenow片段，或E.coliDNA聚合酶Ⅰ大片段。第56页，共86页，2023年，2月20日，星期一①补平3'凹端DNA。②抹平DNA3'凸端。③通过置换反应对DNA进行末端标记。④在cDNA克隆中合成第二链。⑤随机引物标记。⑥应用于双脱氧链末端终止法DNA测序。⑦应用于PCR反应。⑧在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA。Klenow酶功能第57页，共86页，2023年，2月20日，星期一三、T4噬菌体DNA聚合酶来源：T4噬菌体感染的E.coli结构：MW=114000d活性：①5′→3′聚合反应；

②3′→5′外切活性（活性比Klenow酶大200倍，且对单链DNA活性大于双链DNA）第58页，共86页，2023年，2月20日，星期一用途：①填补或标记限制酶切后产生的5′-粘性末端的3′-凹缺末端5′3′补齐或末端标记，同于Klenow5′3′②3′-粘性末端的标记制备DNA探针，同Klenow末端标记③延伸结合于单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物。D诱变引物T4DNA聚合酶诱变DNA第59页，共86页，2023年，2月20日，星期一四、T7噬菌体DNA聚合酶来源：T7噬菌体感染的E.coli结构：由2个蛋白亚基组成：T7噬菌体基因5编码的蛋白&宿主硫氧蛋白活性：①5′→3′聚合，在所有DNA聚合酶中持续反应时间最长，所以合成的DNA链较长，在DNA测序中有很大优越性；

②3′→5′外切活性（由T７噬菌体基因5编码，是Klenow酶的1000倍。

）第60页，共86页，2023年，2月20日，星期一用途：①复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列5′3′3′5′③与T４DNApol一样，平齐粘性末端。④定点突变中互补链的合成。②用填补或交换反应快速进行末端标记。第61页，共86页，2023年，2月20日，星期一测序酶（Sequenase）测序酶是美国UnitedStatesBiochemical公司改造的T7噬菌体DNA聚合酶，切除了99%以上的3'--5'外切活性。改进的Sequenase2.0则切除了所有的3'--5'外切活性，是用双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。第62页，共86页，2023年，2月20日，星期一五、TaqDNA聚合酶（耐热）分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性。1.特点：第63页，共86页，2023年，2月20日，星期一2.用途：①PCR反应；②测序，高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。第64页，共86页，2023年，2月20日，星期一六、DNA末端转移酶分子克隆中常用的末端转移酶来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不依赖于模板的DNA聚合酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶催化dNTP加于DNA分子的3’羟基端，形成同聚物末端。若dNTP为T或C，此二价阳离子首选Co2+

；若dNTP为A或G此二价阳离子首选Mg2+

。第65页，共86页，2023年，2月20日，星期一①克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。用途：②末端标记第66页，共86页，2023年，2月20日，星期一七、反转录酶反转录酶即依赖于RNA的DNA聚合酶，它有5’--3’合成DNA活性，但是无3’--5’外切活性。它来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV（Moloney鼠白血病病毒，又称M-MuLV）。第67页，共86页，2023年，2月20日，星期一用途：①合成cDNA，克隆至载体中；②黏性末端补平、标记；③双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。第68页，共86页，2023年，2月20日，星期一第四节

其它分子克隆工具酶第69页，共86页，2023年，2月20日，星期一一、依赖于DNA的RNA聚合酶来源：SP6噬菌体RNA聚合酶（来源于感染鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株）；

T4或T7噬菌体RNA聚合酶（来源于噬菌体感染的大肠杆菌）。第70页，共86页，2023年，2月20日，星期一

RNA聚合酶实际上就是转录中的RNA合成酶，识别DNA中各自特异的启动子序列，并沿此dsDNA模板起始RNA的合成。无需引物，但需识别特异性位点。活性：①体外合成RNA分子。②用于表达外源基因。用途：第71页，共86页，2023年，2月20日，星期一二、连接酶（Ligase）催化双连DNA片段紧靠在一起的3’羟基和5’磷酸集团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。第72页，共86页，2023年，2月20日，星期一1.T4DNA连接酶PO43->5mM,NaCl>25mM,Ca++>0.1mM只连接ds-DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基特点用途1)相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连抑制剂第73页，共86页，2023年，2月20日，星期一只能连接具黏性末端DNA分子，以NAD作辅助因子2.E.coliDNA连接酶T4RNA连接酶可以催化单链DNA或RNA的5'-磷酸与另一单链DNA或RNA的3'羟基之间形成共价连接。3.T4RNA连接酶第74页，共86页，2023年，2月20日，星期一三、T4多核苷酸激酶1.

催化反应类型1)

激酶活性（5’-磷酸化酶）：可将ATP中的γ位的磷酸基转移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5’-羟基端2)3’-磷酸酶活性（pH5-6）1)5’-端末端标记

2)分子克隆过程中以获得5’-磷酸基末端，便于连接酶反应2.

用途第75页，共86页，2023年，2月20日，星期一四、碱性磷酸酶1)载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率2)核酸末端标记1.

特点1)除去ss-DNA，ds-DNA和RNA分子两端的3’-和5’-磷酸基2)对热稳定2.

用途第76页，共86页，2023年，2月20日，星期一五、核酸酶BAL31核酸酶来源于交替单胞菌（A.espejiana）BAL31，主要活性为3'外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3'端迅速去除单核苷酸，随后可从单链DNA内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短了的平端双链DNA分子（约占10-20%）以及带有约5个核苷酸突出单链的截短分子（约占80-90%）。反应依赖Ca++

，EDTA可抑制其活性。1．BAL31核酸酶第77页，共86页，2023年，2月20日，星期一Sl核酸酶来源于米曲霉（A.oryzae），可降解单链DNA或RNA，是一种单链核酸酶。对dsDNA、dsRNA和DNA:RNA杂交体不敏感。用于分析DNA:RNA杂交体的结构，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链cDNA合成中产生的发荚环。2．Sl核酸酶第78页，共86页，2023年，2月20日，星期一RNaseA来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端。可除去DNA:RNA中未杂交的RNA区，可用来确定DNA或RNA中单碱基突变的位置。广泛用来去