实验大肠杆菌的培养与分离

实验大肠杆菌的培养与分离实验大肠杆菌的培养与分离第1页试验目标:1.进行大肠杆菌扩增，利用液体培养基进行细菌培养操作2.进行大肠杆菌分离,用固体平板培养基进行细菌划线培养3.说明大肠杆菌培养条件和操作要求原理实验大肠杆菌的培养与分离第2页特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有甚至没有细胞结构.且体内普通不含有叶绿素.不能进行光合作用.微生物包含哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基础知识：

(一)微生物：是一切肉眼看不见或看不清楚微小生物总称．实验大肠杆菌的培养与分离第3页(二)细菌常识1、结构2、分裂3、生殖4、变异类型5、在基因工程中应用实验大肠杆菌的培养与分离第4页大肠杆菌实验大肠杆菌的培养与分离第5页细菌外形与大小大肠杆菌属于杆状菌图1-1常见三种细菌经典形态A.球菌B.杆菌C.弧菌实验大肠杆菌的培养与分离第6页细菌营养类型依据细菌所利用能源和碳源不一样将细菌分为两大营养类型。自养菌:异养菌:腐生菌寄生菌大个别病原菌光能自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌实验大肠杆菌的培养与分离第7页细菌革兰氏染色革兰氏染色法是一个用于细菌染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌差异在于细胞壁成份不一样。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌实验大肠杆菌的培养与分离第8页☆

培养基

培养基（培养液）是由人工方法配制而成，专供微生物生长繁殖使用混合营养液。固体培养基和液体培养基、半固体培养基。1.培养基类型(三)细菌培养成份区分：琼脂实验大肠杆菌的培养与分离第9页2.不一样微生物往往需要采取不一样培养基配方3.不论哪种培养基，普通都含有水、碳源、和氮源、无机盐、生长因子等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、氧气、渗透压要求．细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌配方：酵母提取物

0.5g蛋白胨

0.5gNacl

0.5g琼脂

1g水:50ml实验大肠杆菌的培养与分离第10页4.培养基用途液体培养基：扩增细菌、工业生产固体培养基：纯化（分离），判定、保藏菌种实验大肠杆菌的培养与分离第11页单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见，含有一定形态结构子细胞群体，叫做菌落。菌落是判定菌种主要依据。☆菌落

实验大肠杆菌的培养与分离第12页液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长实验大肠杆菌的培养与分离第13页☆无菌技术1.无菌技术概念

无菌操作泛指在培养微生物操作中，全部预防杂菌污染方法。成功地培养微生物关键。实验大肠杆菌的培养与分离第14页（１）消毒定义：2.消毒与灭菌概念及二者区分

（2）灭菌定义：3.常见消毒与灭菌方法是指杀灭病原微生物方法。是指杀灭或去除环境中一切微生物（包含芽胞、孢子）方法实验大肠杆菌的培养与分离第15页1、灼烧灭菌灭菌方法：实验大肠杆菌的培养与分离第16页2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.实验大肠杆菌的培养与分离第17页1.无菌技术除了用来预防试验室培养物被其它外来微生物污染外，还有什么目标？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。假如需要，请选择适当方法。（1）培养细菌用培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）试验操作者双手答：无菌技术还能有效防止操作者本身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。思索1实验大肠杆菌的培养与分离第18页二、大肠杆菌培养和分离试验操作（一）培养基配置与灭菌取2个250ml三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，还未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基——细菌扩充培养LB固体培养基——细菌划线分离封口膜：既通气又不使菌进入实验大肠杆菌的培养与分离第19页（二）倒平板灭菌后培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后马上置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面实验大肠杆菌的培养与分离第20页注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖一边,在酒精灯火焰旁操作.4.需要使锥形瓶瓶口经过火焰，灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既能够使培养基表面水分更加好地挥发，又能够预防皿盖上水珠落入培养基，造成污染.实验大肠杆菌的培养与分离第21页（三）大肠杆菌扩充培养将斜面上培养大肠杆菌菌种接种到灭菌后液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。注意事项:1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌,冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原.实验大肠杆菌的培养与分离第22页（四）大肠杆菌划线分离分离方法:划线分离法和涂布分离法实验大肠杆菌的培养与分离第23页1、划线分离法无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基平板上连续划线.实验大肠杆菌的培养与分离第24页平板划线操作实验大肠杆菌的培养与分离第25页不能使用脱脂棉，不然轻易吸水，造成污染。实验大肠杆菌的培养与分离第26页一旦划破，会造成划线不均匀，难以到达分离单菌落目标；二是存留在划破处单个细胞无法形成规矩菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状菌落。实验大肠杆菌的培养与分离第27页实验大肠杆菌的培养与分离第28页（四）大肠杆菌划线分离注意事项:1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不一样位置连续划线屡次.2.划线首尾不能相接3.划线后,培养皿倒置培养12~24h1、划线分离法实验大肠杆菌的培养与分离第29页问题讨论

1.为何在操作第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，依然需要灼烧接种环吗？为何？

答：操作第一步灼烧接种环是为了防止接种环上可能存在微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留菌种，使下一次划线时，接种环上菌种直接起源于上次划线末端，从而经过划线次数增加，使每次划线时菌种数目逐步降低，方便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留菌种，防止细菌污染环境和感染操作者。实验大肠杆菌的培养与分离第30页2.在灼烧接种环之后，为何要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后划线操作时，为何总是从上一次划线末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌数目比线条起始处要少，每次从上一次划线末端开始，能使细菌数目伴随划线次数增加而逐步降低，最终能得到由单个细菌繁殖而来菌落。实验大肠杆菌的培养与分离第31页2、涂布分离法:是指将培养菌液稀释一定倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.实验大肠杆菌的培养与分离第32页划线分离法和涂布分离法哪个更加好呢？划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。实验大肠杆菌的培养与分离第33页分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌通用方法,也是用于筛选高表示量菌株最简便方法之一实验大肠杆菌的培养与分离第34页（五）大肠杆菌分离后保留1、暂时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保留。2、长久保留：甘油冷冻管藏法实验大肠杆菌的培养与分离第35页1.怎样操作才能够尽可能防止被杂菌污染?(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作标准，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3）注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度实验大肠杆菌的培养与分离第36页2.在培养后怎样判断是否有杂菌污染?（1）菌落形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区分细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区分细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。（3）上述方法较难区分同类不一样物种，需借助化学和深入形态观察，如用革兰氏染色法等。实验大肠杆菌的培养与分离第37页3.进行恒温培养时为何要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中水分会以水蒸气形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；假如正放，则水分形成水滴会落入培养基表面并扩散开。假如培养皿中已形成菌落，则会造成菌随水扩散，极难再分成单菌落，达不到分离目标。实验大肠杆菌的培养与分离第38页4.试验完成后,接种过细菌器皿应怎样处理?全部接触过菌器皿都要先高压灭菌后再洗涤（尤其是培养基）；使用后废弃物也要高压灭菌后再抛弃实验大肠杆菌的培养与分离第39页5.假如分离是转基因大肠杆菌,怎样确保不被普通大肠杆菌所污染?转基因用质粒不是细菌中原有，而是经过改造，通常加入了抗性基因DNA序列，所以可用含有对应抗生素培养基对菌体进行培养。实验大肠杆菌的培养与分离第40页【课堂练习】例1．关微生物营养物质叙述中，正确是（）

A.是碳源物质不可能同时是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外无机物只提供无机盐

D.无机氮源也能提供能量D实验大肠杆菌的培养与分离第41页例2．下面对发酵工程中灭菌了解不正确是（）A.预防杂菌污染B.接种前菌种要进行灭菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前B实验大肠杆菌的培养与分离第42页编号成份含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培养基成份，请据此回答：（1）右表培养基可培养微生物类型是

。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入

.自养型微生物

含碳有机物

实验大肠杆菌的培养与分离第43页（3）若除去成份②，加入