生物制药专题知识讲座

生物制药专题知识讲座生物制药专题知识讲座第1页2第二章基因工程制药生物制药专题知识讲座第2页3第一节

概述

利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养，以取得蛋白质药品过程称为基因工程制药（geneticengineeringpharmaceutics）。

生物技术关键是基因工程，基因工程技术最成功成就是用于生物治疗新型生物药品研制。基因工程能够制备因为材料起源困难而难以广泛应用在疾病诊疗、预防和治疗中有主要价值内源生理活性物质(如激素、细胞因子、神经多肽、调整蛋白、酶类、凝血因子等)以及一些疫苗;基因工程能够制备应用传统技术从动物脏器中提取制备药品；基因工程制药能够防止传统生物制药难以防止病源生物如病毒污染。生物制药专题知识讲座第3页4利用基因工程技术生产药品优点

可大量生产过去难以取得生理活性蛋白和多肽(如胰岛素、干扰素、细胞因子等)，为临床使用提供有效保障;能够提供足够数量生理活性物质，方便对其生理、生化和结构进行深入研究，从而扩充这些物质应用范围;能够发觉、挖掘更多内源性生理活性物质;能够经过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除内源生理活性物质在作为药品使用时存在不足之处,如IL-2第125位半胱氨酸是游离，有可能引发-S-S-键错配而造成活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，IL-2活性以及热稳定性都有提升;可取得新型化合物，扩充药品筛选起源。生物制药专题知识讲座第4页5伴随20世纪70年代DNA重组技术建立，基因工程制药开始得到快速发展。1977年，重组生长激素抑制因子克隆成功后，美国成立了第一家基因工程企业。1982年，美国EliLilly制药企业首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药品诞生。当前，全球上市基因工程药品有140各种，有1700各种处于临床研究阶段，2600各种在试验室研究阶段。其中促红细胞生成素、人重组胰岛素、人重组干扰素、乙肝疫苗、葡萄脑苷脂酶、组织纤溶酶原激活剂、生长激素、白介素-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等年销售额都在5000万美元以上，仅促红细胞生成素1个药销售额就达百亿美元。生物制药专题知识讲座第5页6我国从80年代早期开始基因工程药品开发研究1989年，第一个基因工程药品干扰素同意上市；1992年，第一个基因工程乙肝疫苗投入市场。当前，我国已经有20各种基因工程药品上市，销售额排名世界前10位基因工程药品我国能生产8种，另有150各种处于临床研究阶段。与先进国家相比，我国在基因工程制药上还有相当大差距。伴随我国科学技术水平不停提升，再加上国家重视和大力支持，我国基因工程制药产业将得到快速发展。生物制药专题知识讲座第6页7基因工程药品生产过程

基因工程药品制备主要程序是:

取得目标基因构建DNA重组体将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌工程菌发酵外源基因表示产物分离纯化产品检验等。

第二节基因工程制药基础知识生物制药专题知识讲座第7页8第二节基因工程制药基础知识

基因工程菌构建与筛选

基因重组蛋白分离纯化生物制药专题知识讲座第8页9一、基因工程菌构建与筛选载体

目标基因常见制备方法

载体DNA与目标基因连接

重组DNA导入宿主细胞重组子筛选与判定

原核细胞表示特点及选择

真核细胞表示特点及选择基因工程菌生长代谢特点基因工程菌不稳定性

生物制药专题知识讲座第9页10（一）载体

载体（vector）是携带外源目标基因或DNA进入宿主细胞，实现外源基因或DNA无性繁殖或表示有意义蛋白质所采取一些DNA分子，主要有质粒载体和噬菌体载体。生物制药专题知识讲座第10页111．质粒载体质粒（plasmid）是指独立于原核生物染色体之外含有自主复制能力遗传物质，为双链共价闭合环状DNA分子(covalentyclosedcircularDNA，cccDNA)。质粒大小为1kb~300kb，有三种构型：生物制药专题知识讲座第11页12质粒3种构型共价闭合环状DNA（cccDNA），即两条多核苷酸链均保持完整环状结构，呈超螺旋（SC）构型；开环DNA（ocDNA），即两条多核苷酸链仅一条保持完整环形结构，另一条存在一处或多处缺口；线状DNA（LDNA），即共价闭合环状DNA经限制性内切酶酶切后，发生双链断裂而形成线性分子，称L构型。在琼脂糖凝胶电泳中不一样构型同一质粒DNA虽有相同相对分子质量（Mr），却含有不一样迁移率，迁移速率大小为cccDNA>LDNA>ocDNA。生物制药专题知识讲座第12页13质粒生物特征质粒含有遗传传递和遗传交换能力。质粒DNA依赖宿主编码酶和蛋白质进行复制和转录，但大多数质粒在细胞内可进行独立复制，并随宿主细胞分裂传递到后代。质粒DNA对宿主生存无决定性影响，但能够编码本身蛋白质，表现非染色体控制遗传性状，从而赋予宿主额外特征。质粒含有不相容性。质粒不相容性是指在没有选择压力下，两种亲缘关系亲密不一样质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存，也称为质粒不亲和性。存在于同一宿主细胞中两种亲缘关系亲密不一样质粒，其中一个会在质粒增殖过程中被排斥除去。属于不一样不亲和群质粒则能够在同一宿主细胞中共存。

生物制药专题知识讲座第13页14用于克隆质粒载体要具备三个要素

（1）复制子（replicon），又称复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传原因。复制子分为松弛型复制子和严紧型复制子两类。松弛型复制子复制与宿主蛋白合成功效无关，所以含有这类复制子质粒在每个宿主细胞中拷贝数可到达几百甚至几千。严紧型复制子复制与宿主蛋白质合成相关，所以在每个宿主细胞中为低拷贝数，仅1~3个。（2）选择标识：选择标识（selectablemarker）是由质粒携带赋予宿主细胞新表型基因，用于判定和筛选转化有质粒宿主细胞。（3）多克隆位点：质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成序列称之为多克隆位点（multiplecloningsite）。生物制药专题知识讲座第14页15用于表示质粒载体要具备要素复制子（replicon）选择标识（selectablemarker）多克隆位点（multiplecloningsite）操纵子（operator）转录起始序列（tanscriptioninitiationsequence)转录终止序列（tanscriptionterminationsequence)阻遏子（repressor)开启子（promotor）生物制药专题知识讲座第15页16表示载体可分为原核表示载体和真核表示载体两类①原核表示载体又可分为非融合蛋白表示载体和融合蛋白表示载体。开启子和核糖体结合位点是非融合蛋白表示载体两个必需要素，开启子包含λ噬菌体PL开启子、T7噬菌体开启子、tac开启子、trc开启子等。融合蛋白表示载体包含PET系列载体、硫氧还蛋白融合表示载体、Xpress表示系统、pGEX系列载体（GST基因融合系统）等。②真核表示载体包含不带病毒复制子真核表示载体和带病毒复制子真核表示载体。真核表示载体含有原核基因序列和真核转录单位，能在大肠杆菌中自我复制，也能在真核细胞中进行表示。生物制药专题知识讲座第16页172．λ噬菌体载体

λ噬菌体载体常见于构建基因组文库和cDNA文库。λ噬菌体载体通常分为两类：即插入型载体和置换型载体。插入型载体是指载体中一个酶切位点用于外源DNA插入，置换型载体是指外源DNA经过置换载体上非必需序列插入载体。生物制药专题知识讲座第17页18生物制药专题知识讲座第18页19（二）目标基因常见制备方法

真核细胞基因不能直接从其染色体中取得：真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小一个别，大约为其10-510-7，即使多拷贝基因也只有其10-3，所以从染色体中直接分离纯化目标基因极为困难。真核基因内普通都有内含子，假如以原核细胞作为表示系统，即使分离出真核基因，因为原核细胞缺乏mRNA转录后加工系统，真核基因转录mRNA也不能加工、拼接成为成熟mRNA。

当前克隆真核基因常见方法有化学合成法、PCR法、基因组文库法和cDNA文库法。生物制药专题知识讲座第19页20生物制药专题知识讲座第20页211.化学合成法

较小蛋白质或多肽编码基因能够用人工化学合成法合成。化学合成法有个先决条件，就是必须知道目标基因核苷酸排列次序，或者知道目标蛋白质氨基酸次序，再按对应密码子推导出DNA碱基序列。用化学方法合成目标基因DNA不一样部位两条链寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成黏性末端DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确次序进行退火便连接成较长DNA片段，再用连接酶连接成完整基因。生物制药专题知识讲座第21页22

人工化学合成基因限制

不能合成太长基因。当前DNA合成仪所合成寡核苷酸片段长度在100bp以下，所以此方法只适合用于克隆小分子肽基因。人工合成基因时，遗传密码简并会为选择密码子带来很大困难。如用氨基酸次序推测核苷酸序列，得到结果可能与天然基因不完全一致，易造成突变。费用较高。

生物制药专题知识讲座第22页232.PCR法

聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是依据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参加下，引物依赖DNA模板特异性地扩增DNA。

在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP缓冲溶液中经过以下三个循环步骤扩增DNA：①变性（denaturation）：双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；②退火（annealing）：降低温度，引物与单链模板结合；③延伸（extension）：温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3-OH，引物以5→3方向延伸，最终与单链模板形成双链DNA，并开始下一个变性、退火、延伸循环。生物制药专题知识讲座第23页24生物制药专题知识讲座第24页253.基因文库法

基因文库（genelibrary）是指某一特定生物体全部基因组克隆集合，包含全部外显子和内含子序列。基因文库构建方法为鸟枪法（shotgun），就是将生物体全部基因组经过酶切分成不一样DNA片段，与载体连接构建重组子，转化宿主细胞，从而形成含生物体全部基因组DNA片段库。利用探针原位杂交法等方法筛选含有目标基因重组克隆。生物制药专题知识讲座第25页264.cDNA文库法

cDNA（complementaryDNA）是指与mRNA互补DNA。cDNA文库法是指提取生物体总mRNA，并以mRNA作为模板，在逆转录酶催化合成cDNA一条链，再在DNA聚合酶作用下合成双链cDNA，将全部cDNA都克隆至宿主细胞而构建成cDNA文库。cDNA文库代表了细胞或组织所表示全部蛋白质基因，从中获取基因序列也都是直接编码蛋白质序列。有更多试验室采取更为简便cDNA片段取得法，即直接用逆转录酶从提取mRNA中扩增特异目标基因片段，前提条件是基因序列是清楚，那样才能合成特异性引物。生物制药专题知识讲座第26页27

逆转录法制备cDNA

逆转录法就是先分离纯化目标基因mRNA，再反转录成出cDNA，然后进行cDNA克隆表示。

逆转录法步骤：

逆转录酶从产生该蛋白质真核细胞中提取mRNA合成该逆转录酶或DNA聚合酶I蛋白质mRNA互补DNA(cDNA第一链)，合成编码该多肽双链DNA序列

因为cDNA与模板mRNA核苷酸序列是严格互补，所以cDNA序列只反应基因表示转录及加工后产物所携带信息，即cDNA序列只与基因编码序列相关，而不含内含子。这是制取真核生物目标基因常见方法。生物制药专题知识讲座第27页28(1)mRNA提取与纯化

提取总RNA分离纯化mRNA:

利用mRNA3'末端含有PolyA特点，在RNA流经寡聚dT-纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地结合在柱上；当逐步降低盐浓度洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水洗脱情况下，mRNA被洗脱下来；经过两次寡聚dT-纤维素柱后，就可得到较高纯度mRNA。生物制药专题知识讲座第28页29(2)cDNA第一链合成

普通mRNA都带有3-PolyA，所以可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶催化下，开始cDNA链合成。在合成反应体系中加入一个放射性标识dTNP(如-32P-dATP或-32P-dCTP)，在反应中以及反应后可经过测定放射性标识dTNP掺入量，计算出cDNA合成效率；在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物分子大小，探索最正确反应条件。一次好逆转录反应可使寡聚dT选出mRNA有5%30%被拷贝。生物制药专题知识讲座第29页30(3)cDNA第二链合成

先用碱解或RNaseH酶解方法除去cDNA-mRNA杂交链中mRNA链，然后以cDNA第一链为模板合成第二链。因为第一条cDNA链3末端往往形成一个发夹形结构，所以，能够从这一点开始合成cDNA第二链。此反应是在DNA聚合酶I催化下完成。

核酸酶S1专一性切除单链DNA，所以用它能够切除发夹结构。发夹结构切除后，双链cDNA分子大小常见变性琼脂糖凝胶电泳进行测定。生物制药专题知识讲座第30页31生物制药专题知识讲座第31页32（三）载体DNA与目标基因连接

连接酶催化载体DNA与目标基因DNA片段连接，形成重组子（recombinant），称为DNA分子体外重组。两个DNA片段5-磷酸基团和3-OH在连接酶催化下形成磷酸二酯键。

依据DNA末端类型，载体DNA与目标基因连接能够分为以下几个。生物制药专题知识讲座第32页331．黏性末端DNA片段与载体DNA连接

生物制药专题知识讲座第33页342．平头末端DNA片段与载体DNA连接

平头末端（bluntend）之间连接效率远远低于黏性末端之间连接，约为1/10~1/100。大肠杆菌DNA连接酶不能够催化平头末端之间连接，在高浓度DNA、低浓度ATP、大量T4DNA连接酶存在时，T4DNA连接酶能够催化平头末端之间连接。另外能够经过同聚物加尾法、衔接物连接法和接头连接法进行连接。生物制药专题知识讲座第34页351)加同聚尾连接：用3´末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA3´

末端带上互补同型多聚体序列。如载体加上polyC(或A)尾巴则cDNA加上polyG(或T)尾巴，这两种黏性末端只能使载体与cDNA连接而不能自我环化，借助同型多聚体退火作用形成重组分子，最终用T4DNA连接酶封口。生物制药专题知识讲座第35页36生物制药专题知识讲座第36页372）人工接头连接:

用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头能够使DNA发生连接。

所谓人工接头是指由人工合成、连接在目标基因两端含有一些限制酶切点寡核苷酸片段。

cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到黏性末端，从而能够与载体连接；cDNA中可能也带有一样限制酶切点，为了保护cDNA不受限制酶破坏，确保其完整，能够在加接头前先用甲基化酶修饰这些限制酶切点生物制药专题知识讲座第37页38生物制药专题知识讲座第38页393．影响目标基因与载体之间连接效率主要原因（1）DNA片段之间连接方式：黏性末端连接效率高于平头末端。（2）目标基因与载体浓度和百分比：增加DNA浓度能够提升连接效率，目标基因与载体DNA摩尔数比应大于1。（3）连接温度、时间、连接酶活性及缓冲体系。生物制药专题知识讲座第39页40（四）重组DNA导入宿主细胞

将重组DNA导入宿主细胞，使重组DNA分子进行扩增和目标基因表示。宿主细胞分为原核细胞和真核细胞两类:

（1）原核细胞包含大肠杆菌、枯草杆菌、链球菌等（2）真核细胞包含酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。重组DNA分子导入宿主细胞常见方法包含：转化（transformation）、转染（transfection）、显微注射（microinjection）和电穿孔（electroporation）等。生物制药专题知识讲座第40页411．重组DNA导入大肠杆菌（1）氯化钙转化法：对数生长久大肠杆菌经冰浴氯化钙低渗溶液处理，成为感受态细胞；加入重组质粒，重组质粒与钙离子形成复合物并黏附于细菌细胞膜表面；经42℃热休克处理，重组质粒DNA进入感受态细胞；细胞在不含抗生素培养基中培养一定时间，涂布于含有抗生素培养板上，生长得到转化子。

（2）转染法：以λDNA或黏尾质粒作为载体构建重组DNA经外壳包装成为含有感染能力λ噬菌体颗粒，能将重组DNA注入大肠杆菌，并在大肠杆菌内进行扩增。其详细过程分为三步：包装抽提液制备、体外包装和感染大肠杆菌细胞生物制药专题知识讲座第41页42生物制药专题知识讲座第42页432．重组DNA导入酵母

电转化法、化学转化法、原生质体转化法

（1）电转化法（electroporation）：酵母细胞用山梨醇处理制备感受态细胞，将线性化DNA、感受态细胞置于电转仪中，经过电击将重组DNA导入酵母，电击后加入山梨醇，28℃~30℃培养2天~3天，直至单菌落出现。

（2）化学转化：其过程是：对数生长久酵母经氯化锂或乙酸锂处理，加入重组DNA，在运载DNA（鲑鱼DNA、小牛胸腺DNA）、聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）等存在下，经热休克处理，重组DNA能够进入酵母细胞。生物制药专题知识讲座第43页443．重组DNA导入链霉菌

重组DNA导入链霉菌方法包含原生质体转化法和电穿孔转化法。

原生质体转化法是最为常见方法，链霉菌经处理制备原生质体，原生质体经PEG处理后能够有效吸收重组DNA。

生物制药专题知识讲座第44页454．重组DNA导入哺乳动物细胞（1）显微注射法：在显微镜下，用玻璃毛细管携带DNA注射入细胞核中，导入外源DNA受精卵经体外培养以及分子生物学检测，然后做胚胎移植。（2）电穿孔法（3）DNA-磷酸钙转染法：含有目标基因DNA氯化钙溶液与含有哺乳动物细胞磷酸盐缓冲溶液混合，目标基因DNA与磷酸钙形成白色沉淀复合物黏附于细胞膜表面，并被哺乳动物细胞捕捉进入细胞内。（4）DEAE-葡聚糖转染法：目标基因DNA经多聚阳离子试剂DEAE介导，被导入哺乳动物细胞。（5）阳性脂质体介导基因转染：以阳性脂质体为运载载体，介导目标基因DNA被哺乳动物细胞吞噬。（6）细胞融正当：携带目标基因DNA供体细胞和受体细胞经PEG或仙台病毒等处剪发生融合，目标基因DNA转移至受体细胞。（7）病毒感染法：携带目标基因DNA病毒经外壳包装后成为成熟病毒颗粒，感染哺乳动物细胞，将目标基因DNA整合至受体细胞染色体DNA上。生物制药专题知识讲座第45页46（五）重组子筛选与判定

1．载体遗传标识法

（1）抗生素抗性筛选法：抗生素抗性基因是最常见筛选标识，包含氨苄青霉素（Amp）、四环素（Tet）、氯霉素（Cm）、卡那霉素（Kan）、新霉素（Neo）等。含有转化子被赋予拮抗抗生素表型重组子能在含抗生素环境中生长，从而到达被判定筛选目标。生物制药专题知识讲座第46页47（2）互补筛选法：重组子转化宿主细胞，载体表示产物与宿主细胞中营养缺点型突变发生互补作用，从而实现重组子筛选。最常见为蓝白筛选。生物制药专题知识讲座第47页48生物制药专题知识讲座第48页49生物制药专题知识讲座第49页50（3）营养缺点性筛选法：载体携带一些营养成份（如某种氨基酸）编码基因，而宿主细胞因该基因突变而不能合成该生长所必需营养物质。所以只有含转化子菌落才能够在缺乏该营养物质培养板上生长从而实现筛选。（4）噬菌斑筛选法：经噬菌体载体包装外源重组DNA转染宿主细胞，转化子在固体培养板上出现清楚噬菌斑，不含外源DNA空载体因长度过小不能装配成噬菌体颗粒不能感染宿主细胞形成噬菌斑，从而实现筛选目标。生物制药专题知识讲座第50页51生物制药专题知识讲座第51页522．核酸分子杂交法（1）菌落原位杂交：菌落原位杂交又称探针原位杂交法，制备与目标基因某一区域同源探针序列，依据核酸杂交原理，探针序列特异性地杂交目标基因，并经过放射性同位素或荧光基团进行定位检测。生物制药专题知识讲座第52页53（2）DNA印迹分析：1975年E.M.Southern创造Southern印迹法（Southernblotting），用DNA探针来检测特定序列DNA。其方法是：将待检测DNA混合物进行凝胶电泳分离，分离后DNA片段转移至硝酸纤维素膜，与放射性核素标识DNA探针进行杂交，以检测目标DNA片段。（3）RNA印迹分析：用DNA探针检测特定序列RNA，分析该基因表示及mRNAMr大小。生物制药专题知识讲座第53页54核酸探针杂交生物制药专题知识讲座第54页55生物制药专题知识讲座第55页56生物制药专题知识讲座第56页57Southernblotting生物制药专题知识讲座第57页58生物制药专题知识讲座第58页59生物制药专题知识讲座第59页60生物制药专题知识讲座第60页613．限制性内切酶图谱法从初步筛选转化子中提取重组DNA，选择适当限制性内切酶进行酶切，经过琼脂糖凝胶电泳判定Mr大小，含有目标基因DNA片段酶切产物为阳性克隆。4．DNA序列测定法

限制性内切酶图谱法只能判定外源DNA存在是否，而插入序列正确性必须由DNA测序法进行分析。因为DNA测序技术不停进步，当前已经有生物技术企业利用大型全自动测序仪提供商业化测序服务。5．目标基因表示产物测定法假如重组DNA目标基因能在宿主细胞中表示蛋白质，且宿主细胞本身不含有该蛋白质，那么能够经过检测蛋白质生物功效或结构来筛选和判定重组子。生物制药专题知识讲座第61页62（六）原核细胞表示特点及选择

1．外源基因在原核生物中表示主要调控元件（1）开启子：开启子（promotor）是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成一段序列，其功效是转录出目标基因mRNA，是决定外源基因在原核生物中表示效率关键原因。

强开启子起始mRNA合成效率高，弱开启子起始mRNA合成效率低。

原核生物RNA聚合酶不能识别真核基因开启子，真核基因在大肠杆菌中表示必须将真核基因置于原核开启子控制之下，即原核表示载体开启子为原核开启子。原核开启子有Lac，trp，tac，λpL和T7等，不一样开启子含有不一样调控机制。生物制药专题知识讲座第62页63（2）核糖体结合位点：外源基因在大肠杆菌中表示另一个主要影响原因是核糖体结合位点，即SD序列以及SD序列与起始密码子AUG之间距离。SD（Shine-Dalgarno）序列由Shine和Dalgarno发觉，是mRNA上核糖体结合位点，位于mRNA起始密码子AUG上游3bp~10bp处3bp~11bp长度序列，该段序列富含嘌呤核苷酸，与核糖体16SrRNA3-末端富含嘧啶序列互补，从而与核糖体结合。SD序列与核糖体结合程度、SD序列核苷酸组成、SD序列与AUG之间距离、AUG两侧核苷酸组成、mRNA5-端二级结构等影响外源基因在大肠杆菌中表示效率。生物制药专题知识讲座第63页64生物制药专题知识讲座第64页65生物制药专题知识讲座第65页66生物制药专题知识讲座第66页67（3）终止子：终止子序列（terminatorsequence）是基因3-末端能被RNA聚合酶识别并停顿转录功效特定DNA序列。终止子序列由富含A/T序列和富含G/C序列组成，富含G/C区域含有回文对称结构，转录后形成mRNA含有茎环二级结构，与RNA聚合酶作用使之构象改变，终止RNA合成。生物制药专题知识讲座第67页682．外源基因在大肠杆菌中表示形式

（1）胞内表示：胞内表示有非融合蛋白表示和融合蛋白表示两种方式。1）非融合蛋白胞内表示：非融合蛋白（non-fusionprotein）是指表示外源蛋白N-端不含任何大肠杆菌多肽序列，即将外源基因5-端直接位于翻译起始位点ATG之后。非融合蛋白表示载体中构建模式为：原核开启子→SD序列→起始密码子ATG→外源基因→终止密码子。经过非融合蛋白表示能够取得保持原有生物活性蛋白质，外源蛋白在结构、功效以及免疫原性等方面保持天然状态。但易被蛋白酶所降解而影响蛋白质表示量。非融合蛋白表示时可能形成包涵体。生物制药专题知识讲座第68页692）融合蛋白胞内表示：所谓融合蛋白（fusionprotein）是指将外源基因融合至某种特定原核结构基因下游，表示外源蛋白N-端含原核多肽。融合蛋白表示载体中构建模式为：原核开启子→SD序列→起始密码子ATG→原核结构基因→外源基因→终止密码子。

表示融合蛋白优点：基因操作简便；目标蛋白质不易被细菌酶类所降解；轻易实现高效表示。表示融合蛋白缺点：因为融合蛋白中含有一段原核多肽序列，可能会影响真核蛋白免疫原性，所以普通不能作为人体注射用药。克服表示融合蛋白缺点路径：经特殊设计，使融合蛋白经特异蛋白酶(如凝血因子X、胶原酶、肠激肽酶等)或化学处理(如CNBr水解)能够切除融合蛋白氨基端原核多肽，而取得含有生物活性真核天然蛋白分子。生物制药专题知识讲座第69页70比如：在细菌蛋白和目标蛋白之间加入Ile-Glu-Gly-Arg，这段序列在自然状态蛋白中较少出现，该序列可被凝血因子Xa识别并在C端切开；另外也可在细菌蛋白和目标蛋白之间加入一个Met，CNBr可在Met处专一性地切割，从而形成两条肽链，一条是细菌蛋白，另一条是目标蛋白。生物制药专题知识讲座第70页71（2）分泌表示：外源基因在大肠杆菌中胞内表示是最常见方法，外源基因表示效率可高达大肠杆菌总蛋白10%~70%，但易形成包涵体，所以可采取分泌表示路径表示重组蛋白来改进表示效果。分泌性表示经过将外源基因融合至编码原核蛋白信号肽序列下游实现。信号肽和外源蛋白融合蛋白在跨过内膜或外膜后，信号肽酶切去信号肽，外源蛋白被分泌至细胞周质空间或胞外。生物制药专题知识讲座第71页72细胞周质(periplasm)是指革兰氏阴性细菌中，位于内膜和外膜之间结构个别。周质中表示蛋白质，分离纯化简单，而且周质中氧化环境有利于蛋白质正确折叠，但其融合蛋白产量很低。生物制药专题知识讲座第72页731）分泌至周质：细胞周质分泌路径可取得含有一级结构产物，周质空间中蛋白水解酶较胞内少，有利于外源蛋白稳定性。但周质分泌表示量低于胞内表示，表示量提升一样轻易形成包涵体，影响外源蛋白生物活性。2）分泌至胞外：可经过构建胞外分泌表示载体将外源蛋白分泌至胞外，所以可直接分析培养液中外源蛋白，外源蛋白纯化操作大大简化。生物制药专题知识讲座第73页743．大肠杆菌中外源蛋白表示效率影响原因

影响外源基因在大肠杆菌表示系统中表示原因主要有外源基因密码子、mRNA结构、表示载体、培养条件等。生物制药专题知识讲座第74页75（1）外源基因密码子大肠杆菌等原核生物mRNA使用密码子含有选择性，分为偏好密码子和稀有密码子。经统计发觉8种密码子AGA、AGC、ATA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC是大肠杆菌稀有密码子。在外源蛋白翻译过程中，假如外源基因中使用大肠杆菌偏好密码子，蛋白质合成快速，错配率较低；假如外源基因中使用较多大肠杆菌稀有密码子，蛋白质合成就会受到抑制，发生密码子错配。在表示含高百分比稀有密码子外源基因时，可经过非连续性多核苷酸定点突变方法对cDNA中稀有密码子进行同义突变。生物制药专题知识讲座第75页76（2）mRNA结构mRNA一级结构影响外源蛋白翻译效率。经过定点突变采取大肠杆菌偏好密码子，降低G、C含量，增加A、T含量，调整SD序列与起始密码子AUG之间距离提升外源蛋白表示效率。

翻译起始区二级结构也影响外源蛋白表示效率。翻译起始区包含核糖体结合位点及其它影响翻译效率序列。降低翻译起始区二级结构稳定性能够提升翻译起始效率，提升mRNA稳定性，优化外源蛋白表示。mRNA3非翻译区调控mRNA稳定以及降解速率，经过调控mRNA3非翻译区结构可改进外源基因表示效率。生物制药专题知识讲座第76页77（3）表示载体表示载体是原核表示系统关键。大肠杆菌表示载体普通需满足以下条件，包含重组质粒有较高拷贝数、适用范围广、稳定性高、表示产物轻易纯化等。

生物制药专题知识讲座第77页78

1）外源基因拷贝数

普通来说细菌内基因拷贝数增加，基因表示产物也增加。

将外源基因克隆到高拷贝数表示质粒上，含外源基因重组表示质粒拷贝数增加，必定造成外源基因拷贝数增高，这对于提升外源基因总体表示水平非常有利。生物制药专题知识讲座第78页79

2）外源基因表示效率

影响外源基因表示效率原因有：

开启子强度核糖体结合位点有效性

SD序列和起始密码AUG间距

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①开启子强弱

开启子在转录水平上影响基因表示。

外源基因在大肠杆菌中有效表示，首先必须实现从DNA到mRNA高水平转录，转录水平高低是决定该基因能否高效表示基础。转录水平高低受到开启子等调控元件控制，因另外源目标基因进入受体细胞，就必须受控于受体开启子，所以在载体目标基因上游，必须连有一个适当开启子。

开启子有强有弱，要使目标基因高效表示，需寻找强开启子。生物制药专题知识讲座第80页81

因为真核基因开启子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，所以在进行真核基因高效表示时，必须将真核基因编码区置于大肠杆菌RNA聚合酶能识别强开启子控制下，选择含有强开启子表示载体。常见强开启子有lac、trp、tac、PL、bla等。

将目标基因插入表示载体开启子下游，能够增加基因表示。生物制药专题知识讲座第81页82

②核糖体结合位点有效性

大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中高效表示十分主要。所以必须增加核糖体结合点有效性，消除在核糖体结合位点及其附近潜在二级结构。

③SD序列和起始密码AUG间距

SD序列和起始密码AUG之间距离及其序列对翻译效率有显著影响。调整SD序列和起始密码AUG间隔，改变附近核甘酸序列，可提升非融合蛋白合成水平。表示非融合蛋白关键是原核SD序列和真核起始密码AUG之间距离，距离过长或过短都会影响真核基因表示。

生物制药专题知识讲座第82页83生物制药专题知识讲座第83页84

当外源基因表示时，细胞内降解该蛋白质酶因为应急反应其产量会快速增加。所以，即使原始表示量很高，因为很快在细胞体内被降解，因而实际产量很低。

为提升表示产物在菌体内稳定性，能够采取以下几个方法：

①组建融合基因，产生融合蛋白。

②利用大肠杆菌信号肽或一些真核多肽中本身信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解。

③选取蛋白酶缺点型大肠杆菌为宿主细胞，有可能减弱表示产物降解。

（4）表示产物稳定性

生物制药专题知识讲座第84页85（七）

真核细胞表示特点及选择

原核表示系统缺乏蛋白翻译后加工修饰系统，从而影响外源蛋白生物活性。原核表示系统表示外源蛋白会以包涵体形式存在，蛋白质须经变性、复性处理，难以维持蛋白质原有天然活性。外源蛋白在原核生物中不稳定，轻易被蛋白水解酶降解。

因为大肠杆菌上述缺点，利用真核表示系统表示外源蛋白越来越受到重视。当前基因工程中常见真核表示系统有酵母表示系统、昆虫细胞表示系统和哺乳动物细胞表示系统。生物制药专题知识讲座第85页861.酵母表示系统

酵母表示系统包含酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等表示系统。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源酵母，主要有H.Polymorpha、CandidaBodinii、PichiaPastoris三种，其中在基因工程中应用最为广泛巴斯德毕赤酵母（PichiaPastoris）。生物制药专题知识讲座第86页87巴斯德毕赤酵母表示系统相对于大肠杆菌表示系统主要优点：①高表示量，外源蛋白在毕赤酵母中可取得g/L表示量水平以上；②高稳定性，外源基因被整合至毕赤酵母染色体上，随之复制和遗传，防止了丢失现象；

③翻译后修饰功效，包含信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和O-及N-糖基化、脂类添加等；④分泌表示，培养基中含毕赤酵母本身蛋白较少，主要为分泌表示外源蛋白，所以，有利于后续分离纯化。生物制药专题知识讲座第87页88影响酵母外源蛋白表示效率原因外源基因结构表示形式及信号肽选择开启子选择转化子拷贝数甲醇诱导浓度、时间、温度外源蛋白降解生物制药专题知识讲座第88页89（1）外源基因结构

外源基因mRNA5-端非翻译区（5-UTR）核苷酸序列和长度影响mRNA翻译水平。假如起始密码子旁侧序列轻易形成RNA二级结构，将会阻止翻译进行。富含A-T序列造成转录提前终止而产生缩短mRNA。使用酵母偏爱密码子有利于提升外源蛋白表示量。

生物制药专题知识讲座第89页90（2）表示形式及信号肽选择

外源蛋白表示形式包含胞内表示和分泌表示。分泌表示型酵母可利用本身信号肽和酵母信号肽取得很好表示效果。信号肽包含：α因子信号肽、酸性磷酸酶信号肽等。分泌表示蛋白质常被O-糖基化或N-糖基化，其中主要是在蛋白质氨基酸残基序列Asn-X-Ser／Thr位点处进行N-糖基化，以高甘露糖型糖基化形式存在，寡糖链长度普通为8~14个甘露糖残基，与高等哺乳动物糖基化蛋白结构类似。生物制药专题知识讲座第90页91（3）开启子

要使外源基因在酵母菌中表示，必须将外源基因克隆到酵母菌表示载体开启子和终止子之间，组成“表示框架”。

在酵母菌中经常利用开启子有组成型开启子和诱导型开启子。生物制药专题知识讲座第91页92组成型开启子:标准上在酵母生长各个时期都能发挥作用，不过，当外源基因产物对酵母细胞有不利影响时，过早表示该基因常使酵母菌生长不良以致达不到所需细胞密度，从而影响了总表示产量。通常采取代谢控制方法来个别缓解这类问题，如改换碳源、改变温度等。诱导型开启子：表示受诱导物或诱导条件特异性影响，能够在较大范围内改变表示效率。如PH05开启子表示受培养基中无机磷调整，控制培养基中无机磷含量就可调整该基因表示水平。在低磷酸盐浓度时，表示效率能够提升数十倍至百倍以上。生物制药专题知识讲座第92页93开启子有乙醇氧化酶AOX1，AOX2开启子、PGAP（三磷酸甘油醛脱氢酶开启子）、PFLD1（依赖谷胱甘肽甲醛脱氢酶开启子）等。多数毕赤酵母选择AOX1，AOX2开启子。宿主菌不一样、整合方式不一样可取得三种营养表型：

甲醇利用正表型（Mut+）甲醇利用慢表型（Muts）甲醇利用负表型（Mut-）生物制药专题知识讲座第93页94（4）转化子拷贝数

因为外源基因通常是由多拷贝质粒载体导人宿主细胞，所以质粒拷贝数及其在宿主细胞内稳定性对外源基因表示起决定作用。

有些质粒在导入宿主细胞后，在传代培养中很快丢失，不能用于工业生产。

经过整合质粒，将外源基因整合到宿主染色体上，即使很稳定，但通常只有一个拷贝而不能高效表示。

高度稳定高拷贝数质粒可使外源基因高效表示，但高拷贝数常会引发细胞生长量降低；而单拷贝质粒对细胞最大生长没有影响，因而有时也能到达较高效表示。生物制药专题知识讲座第94页95（5）甲醇诱导浓度、时间、温度

甲醇诱导浓度、时间、温度选择影响外源蛋白表示效率。巴斯德毕赤酵母适宜表示温度为30℃。

生物制药专题知识讲座第95页96（6）终止序列

基因编码区后终止序列对于真核基因表示有主要作用。终止序列确保了转录产物(mRNA)在适当部位终止和加上PolyA尾部，这么形成mRNA可能比较稳定并被有效地翻译。

在酵母中表示人工合成基因普通不含有终止序列，必须借用外加终止序列或载体上现有终止序列。生物制药专题知识讲座第96页97（7）外源蛋白降解

经过选择蛋白水解酶缺失宿主菌进行表示、培养基中添加蛋白胨或酪蛋白水解物等作为蛋白酶底物，调整溶液pH值抑制蛋白水解酶活性等办法，可预防外源蛋白降解。

生物制药专题知识讲座第97页98Twocommonlyusedyeastinmoleculargenetics:Saccharomycescerevisiae(buddingyeast,bakersyeast)Schizosaccharomycespombe(fissionyeast,brewersyeast)生物制药专题知识讲座第98页99S.cerevisiae

生物制药专题知识讲座第99页100non-pathogenic,ediblecontainalltheadvantageofbacterialgeneticsamonocellulareukaryoticcellwithessentiallyalltheorganellesageneticallymanipulablelifecyclewellestablishedmolecularbiologytoolswellstudiedbiochemicalpathwaythesequencesofS.cerevisiaegenomehadbeendeterminedWhat‘sspecialaboutyeast:生物制药专题知识讲座第100页1012．昆虫细胞表示系统

昆虫细胞表示系统（insectcellexpressionsystem）是利用昆虫细胞和杆状病毒载体表示外源蛋白。与其它表示系统比较，该表示系统优点有：①能够表示较大外源基因，能够同时表示多个外源基因；②能够实现不一样生物起源外源基因表示，表示形式为胞内表示和分泌型表示；③蛋白质翻译后加工功效与高等生物类似，外源蛋白保持天然生物活性；④杆状病毒含有宿主专一性，对植物和脊椎动物无致病性，生物安全性高。

生物制药专题知识讲座第101页102昆虫细胞表示载体主要由核型多角体病毒改建而成，该表示载体由大肠杆菌基础质粒插入多角体病毒多角蛋白基因个别DNA序列改造而成。昆虫宿主细胞对杆状病毒感染非常敏感，常见细胞株为sf9和sf21。正常昆虫细胞贴壁生长，18h~24h扩增一代，被病毒感染后，昆虫细胞变大、变圆，且不能贴壁。外源基因与昆虫表示载体连接构建成重组昆虫表示载体，重组载体不能直接感染昆虫细胞，必须经过共转染方式在昆虫细胞内发生同源重组，将外源基因表示单元整合到杆状病毒基因组中成为重组病毒，才能感染细胞进行复制。生物制药专题知识讲座第102页1033．哺乳动物细胞表示系统

在哺乳动物细胞表示系统中表示外源蛋白，蛋白质正确折叠，并能实现准确N型和O型糖基化等各种蛋白质翻译后加工，因另外源蛋白结构、理化性质及生物功效最为靠近天然高等生物蛋白质。

常见哺乳动物细胞株包含CHO细胞、骨髓瘤细胞株、COS细胞、293细胞等，不一样细胞对外源蛋白修饰存在差异。生物制药专题知识讲座第103页104哺乳动物细胞表示系统表示载体可分为病毒载体和质粒载体。病毒载体经过病毒颗粒外壳蛋白与宿主细胞膜相互作用介导外源基因进入细胞内，常见病毒载体包含腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒（SFV）等。质粒载体可用物理或化学方法将外源基因导入细胞。依据质粒是否能够独立于染色体进行自我复制将质粒载体分为整合型和附加型载体两类。整合型载体整合于宿主细胞染色体，附加型载体独立于染色体进行自我复制。生物制药专题知识讲座第104页105哺乳动物细胞表示系统可分为瞬时、稳定和诱导表示系统。瞬时表示是指表示载体导入宿主细胞后，不经选择培养，即时表示，操作简单，周期短，但表示载体随细胞分裂逐步丢失，外源蛋白表示