发酵过程控制

发酵过程控制第1页，共93页，2023年，2月20日，星期一重点掌握:温度、pH、溶解氧、菌体浓度、基质浓度、二氧化碳、泡沫等因素对发酵过程的影响第2页，共93页，2023年，2月20日，星期一第3页，共93页，2023年，2月20日，星期一（5）空气流量空气灭菌系统、流量、温度、目的是供氧。（6）罐压正压防止空气中的杂菌侵入发酵液，罐压过高时CO2

浓度陡增，负面作用。（7）搅拌速度延长空气的停留时间，提高溶氧；促进菌体与培养基之间的质量传递。过高时会损伤菌体、产生过多的泡沫。（8）搅拌功率其成本比重较大。第4页，共93页，2023年，2月20日，星期一（9）粘度菌体浓度增大时，粘度增加，溶氧下降。（10）浊度能直接反应菌体的浓度，但不能区分菌体的死活。（11）料液流量连续发酵时，涉及稀释率。（12）产物浓度生产目标（13）氧化还原电位其原因往往十分复杂。测量手段有待开发。第5页，共93页，2023年，2月20日，星期一（14）废气中的氧含量（15）废气中的CO2

从中可了解生产菌株的呼吸代谢规律。（16）菌丝形态判别种子质量、区分发酵阶段、确认染菌的重要依据。（17）菌体浓度是确定补料量、供气量、阶段转换的重要依据。第6页，共93页，2023年，2月20日，星期一发酵过程的主要控制参数pH值（酸碱度）温度（℃）溶解氧浓度基质含量空气流量压力搅拌转速搅拌功率粘度浊度料液流量产物浓度氧化还原电位废气中的氧含量废气中的CO2含量菌丝形态菌体浓度第7页，共93页，2023年，2月20日，星期一二、发酵过程的参数检测1.直接状态参数2.间接状态参数3.离线发酵分析方法第8页，共93页，2023年，2月20日，星期一1.直接状态参数直接反映发酵过程微生物生理代谢状况的参数。如pH、DO、溶解CO2、尾气O2、尾气CO2、黏度等。在线检测传感器第9页，共93页，2023年，2月20日，星期一2.间接状态参数指那些采用直接状态参数计算求得的参数。比生长速率，摄氧率（OUR）,CO2释放速率，呼吸商（RQ），KLa。可以提供反应过程状态、反应速率、设备性能、设备利用效率等信息。第10页，共93页，2023年，2月20日，星期一3、离线发酵分析方法从发酵液中取出样品进行离线分析,分析菌体浓度，形态、培养基成分和产物成分及含量。显微观察，细胞体积，干重，光密度，平板计数及基质及产物分析等。第11页，共93页，2023年，2月20日，星期一第1节温度对发酵的影响及其控制一、影响发酵温度的因素二、温度对微生物的生长的影响三、温度对发酵的影响四、最适温度的选择第12页，共93页，2023年，2月20日，星期一一、影响发酵温度的因素发酵热：发酵过程中释放出来的净热量。菌分解基质产生热量，搅拌产生热量，罐壁散热，水分蒸发、空气排气带走热量，发酵热引起发酵温度的上升。发酵热大，温度上升快；发酵热小，温度上升慢。第13页，共93页，2023年，2月20日，星期一第14页，共93页，2023年，2月20日，星期一例如一摩尔葡萄糖彻底氧化成水和二氧化碳好氧：产生287.2千焦热量

183千焦转变为高能化合物

104.2千焦以热的形式释放厌氧：产生22.6千焦的热量

9.6千焦转变为高能化合物

13千焦以热的形式释放二例中葡萄糖转化为高能化合物的热量分别占63.7%和42.6%，放出的热量分别为104.2千焦和13千焦。微生物的好氧培养产生的热比厌氧培养多。第15页，共93页，2023年，2月20日，星期一生物热的产生具有强烈的时间性1.初期：适应期，菌量少，呼吸慢，热量少2.对数期：菌量大，呼吸旺盛，热量多3.合成期：菌体合成减缓，靠已合成的酶进行反应，产热减少，温升小。如果培养前期温度上升过缓，发酵不正常；若培养前期温度上升过于剧烈，有可能染菌。此外培养基营养越丰富，生物热也越大。第16页，共93页，2023年，2月20日，星期一搅拌热Q搅拌

搅拌热与搅拌功率有关，可用下式计算：Q搅拌=P*860*4186.8J/hP——搅拌轴功率860*4186.8——机械能转变为热能的热功当量第17页，共93页，2023年，2月20日，星期一蒸发热Q蒸发

通气时引起发酵液的水分蒸发所需的热量叫蒸发热，此外排气也会带走部分热量叫显热Q显，显热很小，一般可忽略。辐射热Q辐射

发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐内与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些。

Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射第18页，共93页，2023年，2月20日，星期一二、温度对微生物的生长的影响微生物生长对温度要求不同，大致可分为：嗜冷菌：20℃最大0℃～26℃生长，嗜温菌：30～35℃15℃～43℃生长，嗜热菌：50℃37℃～65℃生长。最适温度最高温度最低温度第19页，共93页，2023年，2月20日，星期一在最适温度范围内，微生物生长迅速，生长速率随温度升高而增加，温度增加10℃，生长速率增长一倍。超过最高温度微生物即受到抑制或死亡，在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。如黑曲霉生长温度为37。谷氨酸棒状杆菌生长温度为30～32。青霉菌生长温度为30。第20页，共93页，2023年，2月20日，星期一为什么不同微生物对温度要求不同呢？

根据细胞膜脂质成分分析表明不同最适温度生长的微生物，其膜内磷脂组成有很大区别。嗜热菌只含饱和脂肪酸，嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸。

第21页，共93页，2023年，2月20日，星期一三、温度对发酵的影响温度影响反应速率发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适反应温度，低于最适温度，反应速率随温度升高而上升，高于最适温度，发酵速率随温度升高而下降。阿累尼乌斯方程式第22页，共93页，2023年，2月20日，星期一第23页，共93页，2023年，2月20日，星期一根据菌的生长特性，菌体生长快，维持较高温度时间要短些，菌体生长慢，维持较高温度时间可长些温度影响细胞生长，也影响细胞得率，因为在高温下细胞维持生命活动的消耗增加。第24页，共93页，2023年，2月20日，星期一在生长的不同阶段所控制的最适温度也不同。在发酵前期，由于菌量少，培养目的是尽快达到大量的菌体，因此取稍高的温度，促使菌的生长及代谢。中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低些，可以推迟菌体衰老。在稍低温度下，氨基酸合成蛋白质、核酸的正常途径关闭得比较严密，有利于产物合成。第25页，共93页，2023年，2月20日，星期一发酵后期，产物合成能力降低，没有必要延长发酵周期，所以提高温度刺激产物合成到放罐。第26页，共93页，2023年，2月20日，星期一温度影响发酵方向影响关键酶活性改变发酵途径.如四环素产生菌金色链霉菌低于300C时合成金霉素能力较强。温度提高,合成四环素的比例提高。温度达到350C时金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。第27页，共93页，2023年，2月20日，星期一四、最适温度的选择1)最适温度，最适于菌的生长或产物的生成的温度，适合菌体的生长的最适温度发酵产物合成的最适温度2)二阶段的发酵青霉素产生菌最适的生长温度30℃，而青霉素合成分泌的最适温度20℃。第28页，共93页，2023年，2月20日，星期一第29页，共93页，2023年，2月20日，星期一（3）其他发酵条件根据培养条件综合考虑，灵活选择温度。1通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度提高一些；2培养基稀薄时，温度也该低些，因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。第30页，共93页，2023年，2月20日，星期一4）变温培养在抗生素发酵过程中，采用变温培养往往会比恒温培养获得的产物更多。青霉素发酵0～5h,30℃,5～35h25℃,35～85h,20℃,最后回升到25℃培养40小时放罐,比恒温25℃培养提高14.7%第31页，共93页，2023年，2月20日，星期一通用式发酵罐第32页，共93页，2023年，2月20日，星期一工业生产上，所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热，因发酵中释放了大量的发酵热，需要冷却的情况较多。利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇行管中，通过热交换来降温，保持恒温发酵。如果气温较高（特别是我国南方的夏季气温），冷却水的温度又高，致使冷却效果很差，达不到预定的温度，就可采用冷冻盐水进行循环式降温，以迅速降到最适温度。因此大工厂需要建立冷冻站，提高冷却能力，以保证在正常温度下进行发酵。第33页，共93页，2023年，2月20日，星期一第2节pH值对发酵的影响及其控制一、发酵过程中pH值变化的规律二、最适pH值的选择三、pH值的调控策略第34页，共93页，2023年，2月20日，星期一一、发酵过程中pH值变化的规律1.基质代谢（1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降（2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降，尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降，生理酸性物质（如(NH4)2SO4）和生理碱性物质（如NaNO3）。第35页，共93页，2023年，2月20日，星期一2.产物形成某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。3.菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升。第36页，共93页，2023年，2月20日，星期一二、最适pH值的选择选择最适发酵pH的准则是获得最大比生产速率和合适的菌体量,以获得最高产量。利福霉素,最适pH值7.0-7.5第37页，共93页，2023年，2月20日，星期一第38页，共93页，2023年，2月20日，星期一简述一般发酵过程pH值如何变化？

在发酵过程中，随着菌种对培养基种碳、氮源的利用，随着有机酸和氨基酸的积累，会使pH值产生一定的变化。1、生长阶段：菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质，生成铵离子，使pH上升至碱性；随着菌体量增多，铵离子的消耗也增多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。2、生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定。3、自溶阶段：随着养分的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH又上升，此时菌体趋于自溶而代谢活动终止。第39页，共93页，2023年，2月20日，星期一pH值培养时间培养过程中培养液pH值的大致变化趋势由此可见，在适合于菌生长及合成产物的环境条件下，菌体本身具有一定的调节pH的能力，但是当外界条件变化过于剧烈，菌体就失去了调节能力，培养液的pH就会波动。第40页，共93页，2023年，2月20日，星期一将发酵培养基调节成不同的出发pH值，进行发酵，在发酵过程中，定时测定和调节pH值，以分别维持出发pH值，或者利用缓冲液来配制培养基来维持。到时观察菌体的生长情况，以菌体生长达到最高值的pH值为菌体生长的合适pH值。用同样的方法，可测得产物合成的合适pH值。同一产品的合适pH值，与所用的菌种、培养基组成和培养条件有关。在确定合适发酵pH值时，不定期要考虑培养温度的影响。如何确定发酵pH值第41页，共93页，2023年，2月20日，星期一三、pH值的调控策略考虑基础培养基配方,调节好基础料的pH，然后通过加酸碱或中间补料来控制。基础料中含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。有机酸或氨水调节注意监测氧浓度变化防止菌体出现氨中毒。在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3第42页，共93页，2023年，2月20日，星期一如何通过补料调节pH？在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH。（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH。(2）当NH2-N低，pH低时补氨水；当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4。当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH。第43页，共93页，2023年，2月20日，星期一第3节溶解氧对发酵的影响及其控制一、溶解氧变化的规律二、溶解氧在发酵过程控制中的重要应用三、影响溶解氧的主要因素与控制方法四、溶解氧控制对发酵的影响第44页，共93页，2023年，2月20日，星期一一、溶解氧变化的规律溶解氧DO值溶氧电极溶解氧浓度：一般用mg/L或mmol/L表示,一般耗氧菌呼吸临界溶解氧浓度为0.03-0.05mg/L还可以用空气饱和百分比或氧分压表示,以接种前的空气饱和度为100%计算,第45页，共93页，2023年，2月20日，星期一第46页，共93页，2023年，2月20日，星期一溶氧监测的作用1)从发酵液中的溶解氧浓度变化，可以了解微生物生长代谢是否异常。a、溶解氧判断是操作故障或事故引起的异常现象。b、判断中间补料是否恰当。c、溶解氧判断发酵体系是否污染杂菌。d、溶解氧作为控制代谢方向的指标。第47页，共93页，2023年，2月20日，星期一举例：供氧对谷氨酸发酵的影响通风适量生成谷氨酸通风过量生成α-酮戊二酸通风不足生成乳酸或琥珀酸

2)工艺控制是否合理

3)设备供氧能力是否充足。第48页，共93页，2023年，2月20日，星期一谷氨酸发酵时正常和异常的溶氧曲线红霉素发酵过程中溶氧和黏度的曲线第49页，共93页，2023年，2月20日，星期一溶解氧浓度的控制决定因素：供氧和需氧。供氧控制：设法提高氧传递的推动力和Kla。需氧控制：需氧量受菌体浓度、基质种类、和浓度及培养条件等因素影响，以菌浓度影响最明显。发酵液摄氧率随菌浓增加而按比例增加但氧的传递速率随菌浓度的对数关系减少。第50页，共93页，2023年，2月20日，星期一对于好氧发酵过程是否是维持DO值越高越好？即使是专性好氧菌，过高的DO值对生长也可能不利。氧的有害作用是因为新生O，超氧化物基O2-和超氧化物基O22-或羟基自由基OH-，破坏细胞及细胞膜。第51页，共93页，2023年，2月20日，星期一第4节CO2和呼吸商对发酵的影响及其控制一、CO2对菌体的生长和产物形成的影响1CO2影响细胞膜的结构和通透性溶解CO2主要作用于细胞膜的脂肪酸核心部位，而HCO－3则影响磷脂，亲水头部带电荷表面上的蛋白质。当细胞膜的磷脂相中CO2浓度达到临界值时，膜的流动性及表面电荷密度发生变化。这将导致膜对许多基质的运输受阻，使细胞处于“麻醉”状态，生长受抑制，形态发生变化。第52页，共93页，2023年，2月20日，星期一2、抑制代谢溶解在发酵液中的CO2的抑制作用。大多数微生物适应低CO2浓度（0.02％～0.04％体积分数）。当尾气CO2浓度高于4％时，微生物的糖代谢与呼吸速率下降。CO2的溶解度是O2的24倍。应控制罐压。举例：青霉素生产中：CO2浓度0.08×105Pa作用：产物的合成速率↓40％措施：H/D；排气第53页，共93页，2023年，2月20日，星期一第54页，共93页，2023年，2月20日，星期一第55页，共93页，2023年，2月20日，星期一三、呼吸商与发酵的关系摄氧率:OURCO2的释放率(CER)：呼吸商:RQ=CER/OUR：酵母培养时：若RQ=1,表示糖代谢进行有氧分解代谢途径，仅供生长，无产物形成。若RQ>1.1,表示进行EMP途径，生成乙醇。当RQ=0.93,生产柠檬酸；RQ<0.7表示生成乙醇被当作基质再利用。第56页，共93页，2023年，2月20日，星期一呼吸商与发酵的关系1、菌体利用不同基质时RQ值也是不同的。2、在抗生素发酵中生长、维持和产物形成阶段的RQ值也不一样。如青霉素分别0.909，1.0，4.0。3、产物的还原性比基质的还原性大，其RQ值增加。4、当蔗糖、葡萄糖或淀粉等碳水化合物作为呼吸底物时，如果它们被完全氧化RQ值约等于1。5、无氧呼吸时，没有O2的吸收，只有CO2的释放，此时RQ值为无穷大；第57页，共93页，2023年，2月20日，星期一第5节基质浓度对发酵的影响及其控制1、培养基的质量:有机碳源和有机氮源，除规定的外观，含水量，灰分，主要成分含量等参数外，更重要的需经实验评价来确定。2、培养基的数量:控制底物浓度在适当的程度，可以防止底物抑制和阻遏的作用，也可以控制微生物适当的生长阶段。第58页，共93页，2023年，2月20日，星期一糖对青霉素生物合成的影响试验第59页，共93页，2023年，2月20日，星期一如何避免发酵的过程中底物和前体发生抑制和阻遏？根据底物消耗速度连续流加以避免出现不足或过量。具体可以：1、以经验数据或预测数据控制流加；2、以pH、尾气、溶氧、产物浓度等参数间接控制流加；3、以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度，间接控制流加；4、用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加。第60页，共93页，2023年，2月20日，星期一第6节通气搅拌对发酵的影响及其控制影响氧的传递速率影响物料的混合均匀影响泡沫的产生影响菌丝体形态第61页，共93页，2023年，2月20日，星期一第7节泡沫对发酵的影响及其控制

泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系。第62页，共93页，2023年，2月20日，星期一第63页，共93页，2023年，2月20日，星期一第64页，共93页，2023年，2月20日，星期一不同浓度蛋白质原料的起泡作用第65页，共93页，2023年，2月20日，星期一第66页，共93页，2023年，2月20日，星期一三、泡沫的消除1、机械消泡法原理用机械力或压力变化击碎泡沫。方法①罐内法：在搅拌轴上方安装消沫桨，形式多样，击碎泡沫；②罐外法：泡沫引出罐外，喷嘴加速作用或离心破碎泡沫。优点：不用引入外界物质；减小染菌机会；节省原料；不增加下游分离负担；缺点：仅限于泡沫较轻的情况；不能根本解决泡沫生成的原因。第67页，共93页，2023年，2月20日，星期一2、消泡剂消泡消泡剂可使泡沫液局部表面张力降低、液膜排液，因而导致泡沫破灭。对消泡剂的要求（1）消泡能力强，有一定的水性，挥发性小。（2）使用浓度要低。降低成本、减少副作用。（3）对产物无影响。与发酵液不起化学反应。（4）无毒，能耐高温灭菌。（5）便于使用、运输安全，来源方便、价廉。第68页，共93页，2023年，2月20日，星期一第69页，共93页，2023年，2月20日，星期一第70页，共93页，2023年，2月20日，星期一一、高细胞密度发酵成功实例大肠杆菌在基本培养基，葡萄糖、矿物盐或甘油矿物盐，培养方法葡萄糖（甘油）非限制指数补料，细胞干重140～150g/L第8节高密度发酵及控制过程第71页，共93页，2023年，2月20日，星期一第72页，共93页，2023年，2月20日，星期一三、高密度培养发酵技术1、常用搅拌罐和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器，如透析膜反应器、气升式反应器、气旋式反应器等。2工业化生产中常采用搅拌罐和补料工艺来进行高细胞密度发酵。第73页，共93页，2023年，2月20日，星期一四、高密度发酵存在的问题：1、水溶液中的固体与气体物质的溶解度。2、基质对生长的限制或抑制作用；3、基质对产物的不稳定性，挥发性；4、产物或副产物的积累达到抑制生长的水平；5、高浓度的二氧化碳与热的释放速率；6、高的氧需求以及培养基的粘度不断增加等。第74页，共93页，2023年，2月20日，星期一

第9节发酵终点的检测与控制

一、经济因素以最低的成本来获得最大生产能力的时间为最适发酵时间。

1.原料成本高：主要追求提高产率〔kg/(m3·h)〕、得率（转化率）〔kg产物/kg基质〕和发酵系数〔kg产物/（罐容积m3·发酵周期h）〕。此时如果发酵时间过短，则营养物质残留过多，成本高，废水处理成本高。第75页，共93页，2023年，2月20日，星期一2.产品价值高、提纯成本高：要提高产率、发酵系数、产物浓度。要计算总的体积产率〔g产物/（发酵液L·h）〕(内含放罐、洗罐、配料、灭菌等时间)。此时要求尽量缩短辅助工作时间。3.总的生产效益最高。第76页，共93页，2023年，2月20日，星期一二、产品质量因素放罐时间过早：残留的营养成份过高，可能增加后部提取工序的负担。放罐时间过晚：菌体分泌毒素可能增加、有些产物可能开始分解、菌体自溶延长过滤时间。第77页，共93页，2023年，2月20日，星期一三、特殊因素在正常情况下，可根据作业计划，按时放罐；在异常情况下，如染菌、代谢异常（糖耗缓慢等），就应根据不同情况，进行适当处理，以免倒罐。为了能够得到尽量多的产物，应该及时采取措施（如改变温度或补充营养等），并适当提前或拖后放罐时间。第78页，共93页，2023年，2月20日，星期一第79页，共93页，2023年，2月20日，星期一第10节自动控制技术在发酵过程控制中的应用第80页，共93页，2023年，2月20日，星期一2023/4/27发酵过程自控是根据对过程变量的有效测量及对过程变化规律的认识，借助于由自动化仪表和电子计算机组成的控制器，操纵其中一些关键变量，使过程向着预定的目标发展。包括：和过程的未来状态相联系的控制目的或目标（如要求控制的温度、pH值、生物量浓度等）的检测；一组可供选择的控制动作（如阀门的开、关，泵的开、停等）；一种能够预测控制动作对过程状态影响的模型（如用加入基质的浓度和速率控制细胞生长率时需要能表达它们之间相关关系的数学式）。

三者相互联系、相互制约，组成具有特定自控功能的自控系统。第81页，共93页，2023年，2月20日，星期一生物传感器测量原理第82页