认知侵袭性真菌感染的实验室诊断

认知侵袭性真菌感染的实验室诊断第1页/共60页何为侵袭性真菌感染?第2页/共60页DFI（deepfungalinfection）真菌侵犯毛发、表皮、甲床以外的组织（皮下组织、黏膜、肌肉、内脏器官、中枢神经系统等）引起的感染。第3页/共60页DFI中急、危、重者。真菌在组织器官或血液中生长繁殖，导致炎症反应和组织器官损伤，常伴多器官功能障碍。

IFI（invasivefungalinfection）第4页/共60页2007年欧洲癌症治疗研究组织(EORTC)侵袭性真菌感染协作组(IFICG)和美国国立变态反应与传染病研究所霉菌病研究组(NIAID-MSG)将IFI改称IFD。国内未获响应，现仅用于侵袭性念珠菌病(invasivecandidosis,IC)和曲霉病(invasiveaspergillosis,IA)。IFD（invasivefungaldisease）第5页/共60页IFI诊断依据第6页/共60页EORTC和NIAID/MSG2007年修订标准,国内各学会诊治指南。IFI诊断分级：拟诊（possible）临床诊断（probable）确诊（proven）

IFI诊断依据第7页/共60页

IFI分级诊断标准诊断级别高危因素临床特征微生物学检查组织病理学证据拟诊++--临床诊断+++-确诊++++第8页/共60页（1）血液真菌培养阳性，但曲霉、青霉（马尔尼菲青霉除外）需排除污染。（2）导管相关性真菌血症，导管培养与血培养均阳性，且为同一真菌。（3）胸水真菌培养阳性。（4）肺组织真菌培养阳性。（5）合格痰标本或BALF镜检发现肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体。（6）胸水、CSF、血液直接镜检发现新生隐球菌。（7）直接导尿培养念珠菌>105CFU/ml。有确诊价值的微生物学检查第9页/共60页常见IFI病原的诊断第10页/共60页

以下列念珠菌属最常见:

白色—（C.albicans）、光滑—（C.glabrata）、热带—（C.tropicalis）、近平滑—（C.parapsilosis）、克柔—（C.krusei）、都柏林—（C.dubliniensis）、季也蒙—（C.guilliermondii）。北京大学人民医院血液科(2004.4~2005.2间)165株念珠菌，其中：

白念78.8%，其他念珠菌21.2%；张红金等2006.1~6月ICU患者并发IFI137例，其中：

白念65株（47.4%）、光滑36株（26.3%）、热带28株（20.4%）、平滑5株（3.6%）、克柔2株（1.5%）、青霉1株（0.7%）。常见IFI病原（1）念珠菌属（Candida）第11页/共60页单因素分析:

念珠菌定植、WBC＜0.5×109/L持续＞10d、使用碳青霉烯类抗生素是恶性血液病患者发生IC的危险因素；多因素分析:WBC＜0.5×109/L持续＞10d是IC唯一危险因素。IC发病的重要前提是念珠菌定植第12页/共60页（1）革兰染色、乳酸酚棉蓝染色，镜检4~6μm圆或卵圆芽胞，可见出芽，假菌丝。

用含荧光增白剂（CalcofluorWhite，CFW）的10%~20%KOH涂片，紫外线激发呈蓝白或绿色荧光。（2）培养于沙氏培养基生长乳白色酵母样菌落；玉米粉-Tween80琼脂生长假菌丝、厚壁孢子；

CHROMagar培基上（35℃）菌落呈色：白念-绿色，热带-蓝灰，粉红、边缘模糊-克柔。其他种为白色至粉红色。血清（鸡蛋清）中37℃2~3h白念产生芽管。种间鉴别用糖发酵和糖同化试验。常规检查第13页/共60页（1）测抗原胞壁1,3-β-D-葡聚糖（G试验），表面抗原甘露聚糖（LA试验），热不稳定蛋白（LA试验），胞浆蛋白烯醇化酶（ELISA和WB），Mr65000蛋白（抑制ELISA）等。（2）测抗体烯醇化酶（P47）抗体（ELISA），白念珠菌芽管抗体（CAGTA）间接免疫荧光法。血清学试验第14页/共60页（1）以ITSI（internaltranscribedspacer1，内部可转录间隔区1）为靶基因的泛真菌PCR加DNA测序法（可测念珠菌、隐球菌、曲霉、镰刀菌等多种真菌）。（2）泛曲霉念珠菌检测法（pan-ACassay）用种特异探计real-timePCR（常见的6种念珠菌、9种曲霉）。（3）以28SrDNA为靶基因的real-timePCR。可测念珠菌、曲霉、隐球菌、毛霉、青霉等。（4）多串连PCR（multiplextandemPCR，MT-PCR）以ITS1、ITS2、EF1-α、β微管蛋白（β-tubulin）为靶基因，可测常见念珠菌、隐球菌、曲霉、镰刀菌、接合菌等。（5）反向线点杂交（reverselineblothybridization，RLB）和基因芯片（oligonucleotidemicroarray）技术。尚未获批准。分子生物学诊断第15页/共60页185个种中有20多个可致机会性感染常见为:烟曲霉（A.fumigatus）、黄曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）。棒曲霉（A.clavatus）、灰绿曲霉（A.glaucus）、构巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、土曲霉（A.terreus）、焦曲霉（A.ustus）、杂色曲霉（A.versicolor）也有报告。常见IFI病原（2）曲霉菌属（Aspergillus）第16页/共60页曲霉菌孢子是链状的，成熟后脱落，2~5μm，易在空气中悬浮。经空气吸入孢子致病，与定植无关。第17页/共60页

曲霉鉴定主要依靠形态学特征

血清学试验：G试验，GM试验。分子生物学诊断：同念珠菌属。

包括:菌落颜色，分生孢子梗形态、颜色，产孢结构数目，顶囊形态等。烟曲霉耐高温，40℃（38.5~50℃）生长良好。第18页/共60页约78个种，致病的约17个种和8个变种，引起IFI的主要为:---新生隐球菌（C.neoformans），

---有新生变种（var.neoformans）（血清型D型），

---格特变种（var.gatii）（B、C型），

---grubii变种（var.grubii）（A型）。在A、B、C、D、AD血清型中，我国已见A、D及AD型，A型最多。常见IFI病原（3）隐球菌属（Cryptococcus）第19页/共60页感染途径：经呼吸道吸入孢子（可从鸽粪、按树分离），侵犯肺与神经系统。鉴定要点：沙氏培养基25℃~37℃均生长。CSF直接或离心沉淀物涂片墨汁染色发现圆或椭圆双层厚壁孢子，外有宽荚膜。菌体可见单个出芽。第20页/共60页血清学试验：隐球菌荚菌多糖抗原胶乳凝集试验(LA),试剂盒法国PaxtorexTMCryptoPlus,红色胶乳颗粒包被抗糖醛酸木糖甘露聚糖(GXM)单抗。标本：血清、CSF、BALF、尿，血清和CSF用链霉蛋白酶56℃、30min预处理。假阳性：RF>500IU/ml时(9/26)；TB患者血清(2/26)。1:4稀释转阴。ELISA法：多抗包被，酶标记单抗检测。不受RF干扰。分子生物学诊断：同念珠菌属。第21页/共60页组织病理中的隐球菌（PAS）第22页/共60页墨汁染色中的隐球菌第23页/共60页隐球菌性脑膜炎诊断脑脊液检查墨汁涂片培养动物接种电镜观察荚膜抗原乳胶凝集试验（LAT）分子生物学的方法涂片和培养对于诊断具有决定意义第24页/共60页直接墨汁涂片阳性率大约为60%优点：快速简便、可做菌体计数当脑脊液中的菌体数较少（低于103/mm3

）常常会有假阴性结果，需要做进一步的检查第25页/共60页真菌培养对本病的诊断有决定意义，是确诊的金标准诊断的敏感性高于直接真菌涂片脑脊液真菌培养的方法，对于培养的结果具有重要的影响第26页/共60页荚膜抗原乳胶凝集实验（LAT）LAT是以高效价的抗隐球菌荚膜多糖抗体吸附于标准大小的乳胶上，检测血清或CSF标本中的隐球菌荚膜抗原。特异性接近100%，敏感性约为95%与菌体计数具有平行性，对于预后判断有帮助第27页/共60页属真菌界，子囊菌门，古子囊菌纲，肺孢子菌目，肺孢子菌科，肺孢子菌属。1909年Chagas首先发现（克氏锥虫），至上世纪80年代一直归为原虫（真菌培养基不生长；细胞膜无麦角固醇，对麦角醇合成抑制剂类抗真菌药耐药，但对抗原虫药敏感）。常见IFI病原（4）卡氏肺孢子菌（Pneumocystiscarinii）第28页/共60页直接镜检：痰（30%）、BALF（75%）、经皮穿刺肺活检（60%）、开胸肺活检（95%）查找包囊等。染色法：Gomori’s环六亚甲基四胺银（GMS），亚甲胺蓝、荧光素染色（染包囊壁和囊壁括弧样结构）。培养：

Uero、CEI、WI-38、MRC-5和Chang肝细胞等。第29页/共60页血清学试验：查抗原：荧光素标记单抗测标本中包囊、滋养体，阳性率97%~99%。查抗体：ELISA、IIF、WB查抗体，阳性率50%~90%，假阳性率高。WB法测抗Mr35000~45000抗体，提示活动感染。分子生物学诊断：同念珠菌属。第30页/共60页无性型在孢子囊内形成不能游动的静孢子，有性型形成接合孢子。毛霉目（Mucorales）、虫霉目（Entomophthorales）中部分种可致毛霉病（mucormycosis）或接合菌病（zygomycosis）。常见IFI病原（5）接合菌（Zygomycetes）第31页/共60页毛霉属（Mucor）、根霉属（Rhizopus）、犁头霉属（Absidia）、根毛霉属（MucorRhizomucor）、被孢霉属（Mortierella）、共头霉属（Sycephalastrum）、小克银汉霉属（Cunninghamella）、瓶霉属（Saksenaea）等致病的种多。吸入孢子、创伤感染、食入污染食物致病。特点是菌丝侵犯血管，引起栓塞、组织坏死、化脓性反应和肉芽肿。最常播散至脑，鼻窦炎、眶窝织炎、肺炎。鼻脑毛霉病占30%~50%，病死率80%~90%，次为肺、胃、肠毛霉病。毛霉目中有7个科、12属、24种致病第32页/共60页直接镜检标本中见90°角分支的宽大、透明、无分隔或极少分隔菌丝可诊断。确诊须从组织切片中找到菌丝。虫霉目中1科、2属、3种致病：蛙粪霉属(Basidiobolus)中的固孢蛙粪霉(B.haptasporus)，耳霉属(Conidiobolus)中的冠状耳霉(C.coronatus)和异孢耳霉(C.incongruus)。传入途径:微小外伤，昆虫叮咬。第33页/共60页直接镜检标本中宽大、不规则，无分隔的薄壁真菌菌丝及其片段。分子生物学诊断：同念珠菌属。第34页/共60页25℃菌丝相、37℃酵母相的致病真菌包括申克孢子丝菌，马尔尼菲青霉、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌等。有的有地域分布特点；对人致病力强，感染无须免疫受损。常见IFI病原（6）双相型真菌第35页/共60页申克氏孢子丝菌

镜下特征纤细分支分隔菌丝直角分枝的分生孢子梗，顶端梨形或圆形小分生孢子，呈“梅花瓣样”结构有的小分生孢子沿菌丝两侧排列，呈“袖套状”酵母相镜下可见革兰阳性卵圆形或梭形孢子第36页/共60页第37页/共60页第38页/共60页自然界土壤、竹笋、甘蔗中（25℃）多以菌丝形式存在，组织中形成酵母样细胞，两端钝圆，有横隔。竹鼠为带菌动物。吸入本菌孢子或食入霉变甘蔗发病。侵犯单核吞噬细胞系统，全身重要脏器均可受累。所致IFI70%见于AIDS患者。马尔尼菲青霉（Penicilliummarneffei）第39页/共60页骨髓、外周血涂片，皮肤、淋巴结活检组织涂（切）片，溃疡分泌物涂片，巨噬细胞内外直径2~3μm，有1~3个横隔的椭圆（腊肠）形细胞。糖原染色可与黑热病LD小体和荚膜组织胞浆菌鉴别。培养阳性为诊断金标准。阳性率骨髓100%，皮损90%，血液76%。血清学试验检测Mp1基因编码的本菌特异的胞壁甘露糖蛋白Mp1P抗原或其特异抗体。分子生物学诊断：同念珠菌飞行属。第40页/共60页马尔尼菲青霉

鉴定依据双相菌直接或病理检查找到腊肠形孢子菌落特征（培养基被染成红色）和镜下结构（帚状枝及孢间连体）在察氏培养基上生长不良（麦芽汁培养基上生长良好）第41页/共60页菌丝相酵母相第42页/共60页菌丝相(正面)第43页/共60页菌丝相(反面)第44页/共60页马尔尼菲青霉第45页/共60页腊肠形孢子第46页/共60页某些种与大骨节病、克山病、食管癌有关，在真菌性角膜炎中占58.7%。可致心、脑、肺感染和真菌血症。引起的IFI逐年增多，发病率、死亡率仅次于白念珠菌和曲霉所致感染。吸入本菌致肺感染，类似IA。侵犯血管引起血栓致组织坏死。常见IFI病原（7）镰刀菌属（Fusarium）第47页/共60页特征：典型镰刀形大分生孢子，大、小不等，有2～5个分隔。但即使多次分离出同一真菌也只能是疑诊。确诊：培养阳性，病理组织切片发现本菌。第48页/共60页介绍两个实验

GM试验

G试验

第49页/共60页

GM试验

检测曲霉半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）抗原。试剂盒：Bio-Rad公司PLATELIATMAspergillusEIA.

原理：一步酶免疫夹心微孔板法……第50页/共60页（1）GM连续2次阳性有临床诊断价值。（2）GM阴性不能排除IA（GM低于可测限）；高危患者应每周2次筛查。（3）A值<0.000提示操作、试剂、仪器有误，应复测。（4）假阴性：见于慢性肉芽肿病，Job’s综合征及某些用抗真菌药治疗的IA患者。结果解释：第51页/共60页（5）假阳性：①青霉属（Penicillium）、交链孢属（Alternaria）、拟青霉属（Percilomyces）、地丝菌属（Geotrichum），组织胞浆菌属（Histoplasma）真菌与EBA-2单抗有交叉反应。②某些谷类制品、乳脂点心中含半乳呋喃糖（galactofuranose），牛奶制品（humanizedmilks）含高浓度GM，常在婴儿造成GM假阳性。③某些批次半合成β内酰胺抗生素（piperacillin/tazobactam，amoxicillin与clavulanicacid）中含GM抗原。（6）GM试验对中性粒细胞减少症IA患者诊断价值较高，对非中性粒细胞减少的IA诊断价值较差。第52页/共60页

G试验：检测真菌(念珠菌、曲霉、肺孢子菌等)壁1,3-β-D葡聚糖(glucan).适用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、镰孢霉等引起的感染。试剂盒:Glucatell(美国CapeCode公司),2003年美国FDA批准,美洲鲎:界值60pg/ml。

Fungitec.G(日本SeikagakuKogyo公司),东方鲎: