药典无菌检查方法验证及操作要点

药典无菌检验法

方法验证及操作关键点饶春意药典无菌检查方法验证及操作要点第1页1序言1.1定义无菌检验法系用于检验药典要求无菌药品、原料、辅料及其它品种是否无菌一个方法。若供试品符合无菌检验法要求，仅表明了供试品在该检验条件下未发觉微生物污染。药典无菌检查方法验证及操作要点第2页1.2试验环境条件要求无菌检验应在环境洁净度10000级下局部洁净度100级单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格恪守无菌操作，预防微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定时按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法》现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关要求进行验证，其内部环境洁净度须符合无菌检验要求。药典无菌检查方法验证及操作要点第3页2.培养基2.1培养基灭菌配制后应采取验证合格灭菌程序灭菌。

2.2培养基保留制备好培养基应保留在2～25℃、避光环境。培养基若保留于非密闭容器中，普通在三周内使用；若保留于密闭容器中普通可在一年内使用。

药典无菌检查方法验证及操作要点第4页2.3培养温度硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。改良马丁培养基置23～28℃培养。2.4培养基适用性检验无菌检验用硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基无菌性检验及灵敏度检验要求。2.4.1无菌性检验每批培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14天，应无菌生长。药典无菌检查方法验证及操作要点第5页2.4.2灵敏度检验菌种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌株传代次数不得超出5代培养基接种每种菌接种至2管对应培养基，另取一支不接种作空白对照，按要求温度时间培养。结果判断空白对照管应无菌生长，每种菌接种后2管培养基管均生长良好，该培养基灵敏度检验符合要求。药典无菌检查方法验证及操作要点第6页金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养3天；白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁培养基中23～28℃培养5天。药典无菌检查方法验证及操作要点第7页3.稀释液、冲洗液及其制备方法0.1％蛋白胨水溶液pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液药典无菌检查方法验证及操作要点第8页4.方法验证试验目标:1)证实所采取方法适合于该药品无菌检验2)确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性能够忽略不计。3)确保在实际检验条件下，该供试品无菌检验法准确性、有效性和重现性。验证时，按“供试品无菌检验”要求及以下要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。药典无菌检查方法验证及操作要点第9页

4.1菌种1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]2）铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugznosa)[CMCC(B)10104]3）枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]4）生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]5）白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]6）黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]药典无菌检查方法验证及操作要点第10页4.2菌液制备制备菌液，普通当日使用。金黄色葡萄球菌（铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌)营养肉汤（或营养琼脂培养基）生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃培养18～二十四小时；白色念珠菌改良马丁培养基（或改良马丁琼脂培养基）23～28℃培养24～48小时上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位)菌悬液。药典无菌检查方法验证及操作要点第11页

黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱吸出孢子悬液(用管口带有薄无菌棉花或纱布能过滤菌丝无菌毛细吸管)至无菌试管内用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数小于l00cfu孢子悬液。药典无菌检查方法验证及操作要点第12页4.3薄膜过滤法将要求量供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最终一次冲洗液中加入试验菌（小于100cfu），过滤。取出滤膜接种至对应培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一滤桶，不过滤供试品，其它操作同上，作为对照.将含培养基容器按要求温度培养3～5天。各试验菌及对应培养基逐一进行验证。药典无菌检查方法验证及操作要点第13页金葡铜绿白念金葡铜绿白念加供试品对照管枯草生孢黑曲霉枯草生孢黑曲霉药典无菌检查方法验证及操作要点第14页4.4直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接人小于l00cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；

取符合直接接种法培养基用量要求改良马丁培养基4管，分别接入小于l00cfu白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接人要求量供试品，另1管作为对照，按要求温度培养3～5天。药典无菌检查方法验证及操作要点第15页4.5结果判断与对照管比较，如含供试品各容器中试验菌均生长良好，则供试品该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用能够忽略不计，照此检验法和检验条件进行供试品无菌检验。如含供试品任一容器中微生物生长微弱、迟缓或不生长，则供试品该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采取1)增加冲洗量，或增加培养基用量，2)使用中和剂，或更换滤膜品种等方法，消除供试品抑菌作用，并重新进行方法验证。药典无菌检查方法验证及操作要点第16页5.供试品无菌检验5.1无菌检验法包含薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采取薄膜过滤法。进行供试品无菌检验时，所采取检验方法和检验条件应与验证方法相同药典无菌检查方法验证及操作要点第17页5.2检验数量与检验量检验数量抗生素类药品没有单列开，抗生素类药与非抗生素类药品最少检验量是相同。表1、表2、表3中最少检验数量不包含阳性对照试验供试品用量，也不包含验证试验用量。普通情况下，供试品无菌检验若采取薄膜过滤法，应增加l／2最小检验数量作阳性对照用。只要供试品特征允许，应将全部容器内全部内容物过滤。若采取直接接种法，应增加供试品1支(或瓶)作阳性对照用。药典无菌检查方法验证及操作要点第18页检验量每份培养基接种供试品量按表2、表3要求。表2上市抽验样品(液体制剂)最少检验量供试品装量V(ml)每支样品接入每管培养基最少样品量最少检验数量（瓶或支）最少检验数量（不含阳性对照试验）供试品检验（包含阳性对照试验）薄膜过滤法直接接种法≤11<V<55≤V<2020≤V<5050≤V<10050≤V<100（静脉给药）100≤V<500V≥500全量半量2ml5ml10ml半量半量500ml20①10101010106620+1010+510+510+510+510+56+36+320+110+110+110+110+110+16+16+1药典无菌检查方法验证及操作要点第19页表3上市抽验样品（固体制剂）最少检验量供试品装量M（瓶或支）每支样品接入每管培养基最少样品量最少检验数量（瓶或支）最少检验数量（不含阳性对照试验）供试品检验（包含阳性对照试验）薄膜过滤法直接接种法M<50mg50mg≤M<300mg300mg≤M<5gM≥5g一次性使用含药产品全量半量150mg500mg整个产品20①101010②1020+1010+510+510+510+520+110+110+110+110+1药典无菌检查方法验证及操作要点第20页5.4供试品处理及接种培养基5.4.1薄膜过滤法薄膜过滤法应优先采取封闭式薄膜过滤器，也可使用普通薄膜过滤器。水溶性供试液过滤前先将少许冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为l00ml，且总冲洗量不宜过大，以防止滤膜上微生物受损伤。药典无菌检查方法验证及操作要点第21页水溶液供试品取要求量，直接过滤，或混合至含适量稀释液无菌容器内，混匀，马上过滤。如供试品含有抑菌作用或含防腐剂，须用适量冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不得少于三次。冲洗后，如用封闭式薄膜过滤器，分别将l00ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入对应滤筒内。如采取普通薄膜过滤器，取出滤膜，将其剪成3等份，分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基容器中，其中一份做阳性对照用。药典无菌检查方法验证及操作要点第22页可溶于水固体制剂供试品Β-内酰胺类供试品非水溶性制剂供试品油性供试品药典无菌检查方法验证及操作要点第23页5.4.2直接接种法每个容器中培养基用量应符合接种供试品体积不得大于培养基体积10％，同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于lOml。培养基用量和高度同方法验证试验；每种培养基接种管数同供试品检验数量。药典无菌检查方法验证及操作要点第24页

若符合直接接种法供试品装量V(ml)，1<V<5时，要求最少检验数量为10支，即供试品作无菌检验时，最少检验数量为11支，以无菌操作各将11支供试品取半量分别接种于11管硫乙醇酸盐流体培养基中，取其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液（菌量小于l00cfu），作阳性对照，再将10支供试品中剩下半量分别接种于10管改良马丁培养基中，按要求温度和时间培养。药典无菌检查方法验证及操作要点第25页可溶于水固体制剂供试品Β-内酰胺类供试品非水溶性制剂供试品药典无菌检查方法验证及操作要点第26页5.5培养含硫乙醇酸盐流体培养基容器于30～35℃、含改良马丁培养基容器于23～28℃,

均培养14天。药典无菌检查方法验证及操作要点第27页

5.6结果判断符合要求供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合要求。不符合要求供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合要求。