基因工程常规技术核酸提取纯化

第4章

基因工程常规技术目前一页\总数七十页\编于八点由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法DNA的提取与纯化2目前二页\总数七十页\编于八点一、质粒DNA的提取

较为常用的有碱抽提法、煮沸法和去污剂裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（<15kb）,去污剂法比较温和，一般用于分离大质粒。3目前三页\总数七十页\编于八点plasmidDNAGenomicDNA4目前四页\总数七十页\编于八点大肠杆菌基因组DNA5目前五页\总数七十页\编于八点分离方法的原理：质粒DNA与细菌DNA物理性质上的一些差异，其中最明显的是分子大小。最大的质粒是大肠杆菌染色体的8％，绝大多数质粒远远小于它6目前六页\总数七十页\编于八点闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快。原理DNA双链变性DNA单链复性强碱中性1.碱抽提法提取质粒DNA7目前七页\总数七十页\编于八点染色体线性DNA或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性8目前八页\总数七十页\编于八点菌液收集及裂解细菌收集通过离心进行，不同的质粒拷贝数，菌液的需求量不同。9目前九页\总数七十页\编于八点细菌的裂解是在碱性环境下进行的，不同的宿主菌细胞壁厚薄有差异：革兰氏阳性菌——不用特殊处理，碱裂解即可有效破壁革兰氏阴性菌——溶菌酶酵母和丝状真菌——破壁酶或玻璃珠研磨10目前十页\总数七十页\编于八点所用的试剂作用①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。11目前十一页\总数七十页\编于八点③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS：溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白-SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。12目前十二页\总数七十页\编于八点冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑤KAc-HAc缓冲液13目前十三页\总数七十页\编于八点⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。14目前十四页\总数七十页\编于八点蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑨酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。15目前十五页\总数七十页\编于八点碱抽提法提取质粒DNA的步骤SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA一次配置100ml，灭菌后4度保存。16目前十六页\总数七十页\编于八点溶液II破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性SolutionII的配制(现用现配，室温使用)：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M乙酸钾（用冰乙酸调pH至4.8）17目前十七页\总数七十页\编于八点上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇。第五步：纯化DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA18目前十八页\总数七十页\编于八点2.使用试剂盒提取质粒DNA市售的质粒提取试剂盒大都采用碱抽提法，不同之处在于纯化方式。目前比较常用的纯化系统是硅基质吸附材料。19目前十九页\总数七十页\编于八点原理：在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，然后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、转化转染等分子生物学下游实验。20目前二十页\总数七十页\编于八点天根生化质粒提取试剂盒提取流程21目前二十一页\总数七十页\编于八点22目前二十二页\总数七十页\编于八点最重要的是：菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。影响质粒DNA产量的因素23目前二十三页\总数七十页\编于八点这是直接决定DNA产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定。24目前二十四页\总数七十页\编于八点若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量g/mlpGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.1225目前二十五页\总数七十页\编于八点一般过程及原理：1.细菌基因组DNA的制备（1）细胞裂解物理方法：以机械力的方法打破细胞外的屏障化学方法：将细胞暴露在能够对细胞整体结构产生影响的化学药物中，包括一种能够攻击细胞壁的成分和一种能够除去细胞膜的成分常用于大肠杆菌的裂解液成分：10%SDS、EDTA和溶菌酶二、基因组DNA的提取26目前二十六页\总数七十页\编于八点（2）DNA纯化细菌提取物包含：DNA;大量的蛋白质和RNA（属于多余成分）去蛋白质的标准方法：加入苯酚;或1:1的苯酚与氯仿的混合物。原理：能沉淀出蛋白质但仍保留核酸(DNA和RNA)在水溶液中。27目前二十七页\总数七十页\编于八点结果：细胞提取物和有机溶剂逐渐混合并离心后，沉淀出的蛋白质分子会聚集在水溶液和有机溶剂分层的两相界面处形成白色的凝集物,水溶液中的核酸分子就能够用吸管分离出来。28目前二十八页\总数七十页\编于八点29目前二十九页\总数七十页\编于八点一些RNA分子，特别是mRNA，会在苯酚处理过程中被除去，但是绝大多数的RNA都和DNA一起保留在水溶液中。最有效的除去RNA的方法：

使用核糖核酸酶，它能够迅速降解RNA分子，把它们变成单核苷酸30目前三十页\总数七十页\编于八点常用：无水乙醇、异丙醇乙醇沉淀法的额外优点是将短链和单体核酸成分留在了溶液中。核糖核酸酶处理产生的核苷酸因此在这一步得到了去除。（3）沉淀DNA31目前三十一页\总数七十页\编于八点32目前三十二页\总数七十页\编于八点33目前三十三页\总数七十页\编于八点一般过程及原理：动物组织剪成小块，匀浆或置液氮中冻结后研磨成细粉末。组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）组织粉碎2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提34目前三十四页\总数七十页\编于八点0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC温育。（2）细胞裂解（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。（5）除去RNA污染RNase。无水乙醇（可以加入1/10体积的3M乙酸铵辅助沉淀）异丙醇（4）沉淀DNA35目前三十五页\总数七十页\编于八点一般过程及原理：（1）组织粉碎用液氮冷冻后研磨成细粉末。3.从植物组织中制备DNA（2）细胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。65oC温育1h左右。2%CTAB抽提缓冲液：CTAB10g；5MNaCl140ml；0.5MEDTA25ml；1MTris-Cl（pH8.0）50ml；加ddH2O定容至500ml。36目前三十六页\总数七十页\编于八点用0.6倍体积的异丙醇（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）。37目前三十七页\总数七十页\编于八点三、噬菌体DNA的提取

噬菌体DNA一般都是从噬菌体颗粒中制得，不从被侵染细胞中制得，因此不存在被细菌DNA污染的问题。但除去噬菌体衣壳过程中需要用到专门技术。一个例外：M13噬菌体的双链复制模式，像细菌质粒一样，M13噬菌体DNA也能够从被侵染的大肠杆菌中获得。38目前三十八页\总数七十页\编于八点噬菌体颗粒能够从被侵染细菌的细胞外培养基中大量获得。当这样的培养物被离心时，细菌聚集成小球沉淀在离心管的底部，把噬菌体颗粒留在了悬液中,噬菌体颗粒接着被从悬液中收集起来。噬菌体DNA需要经过一个去除蛋白的步骤以除去蛋白衣壳后才能够得到。39目前三十九页\总数七十页\编于八点40目前四十页\总数七十页\编于八点溶源性λ噬菌体的制备：被侵染培养物主要是由含有已经整合到细菌染色体的前噬菌体的细胞所组成，在这种环境下，细胞外的λ噬菌体浓度非常低。为了得到高产量的细胞外λ噬菌体，培养物必须被诱导，以使所有细菌进入侵染循环中的溶解阶段，导致细胞死亡并将λ噬菌体颗粒释放到培养基中1.λ噬菌体DNA的抽提41目前四十一页\总数七十页\编于八点42目前四十二页\总数七十页\编于八点非溶源性λ噬菌体的制备绝大多数的噬菌体都是溶源性噬菌体，但很多源自λ噬菌体的克隆载体都经过了改造，切除了一些基因以消除细菌的溶源性。因此这些噬菌体就不能够整合到细菌基因组中，并且只能够通过细菌溶解循环来侵染细胞。43目前四十三页\总数七十页\编于八点存在的问题：噬菌体在细胞分裂达到其最大分裂速度之前加入，所有细胞都会立刻溶解，这样得到的噬菌体浓度非常低。另一方面，如果细胞密度太高的情况下加入噬菌体，培养物不能够彻底溶解，所得的噬菌体浓度也比较低。44目前四十四页\总数七十页\编于八点45目前四十五页\总数七十页\编于八点噬菌体颗粒在上清液中一般过程及原理：（1）离心收集噬菌体颗粒（2）聚乙二醇(PEG)沉淀噬菌体颗粒聚乙二醇是一种长链多聚化合物，在盐存在下，能够吸收水分，使像噬菌体颗粒这样的大分子聚集沉淀（3）重悬噬菌体颗粒收集并在一个适当的小体积中重新溶解46目前四十六页\总数七十页\编于八点（4）CsCl密度梯度离心47目前四十七页\总数七十页\编于八点（5）透析除去CsCl48目前四十八页\总数七十页\编于八点（6）除去蛋白质有机溶剂法、酶法（7）沉淀DNA无水乙醇、异丙醇49目前四十九页\总数七十页\编于八点2.M13噬菌体DNA的抽提被侵染培养物的生长；离心沉淀细菌；PEG沉淀噬菌体颗粒；苯酚抽提分离噬菌体蛋白外壳；乙醇沉淀浓缩制得DNA。一般过程及原理：50目前五十页\总数七十页\编于八点51目前五十一页\总数七十页\编于八点1.紫外光谱法DNA（或RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。原理：蛋白质在280nm处有吸收峰四、DNA的定量和纯度测定52目前五十二页\总数七十页\编于八点53目前五十三页\总数七十页\编于八点溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发红色荧光。2.琼脂糖凝胶电泳估计原理：与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。54目前五十四页\总数七十页\编于八点一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。五、DNA分子量的估计MarkerMarker55目前五十五页\总数七十页\编于八点DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker56目前五十六页\总数七十页\编于八点57目前五十七页\总数七十页\编于八点总RNA的提取与纯化

不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105中丰度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mgRNA分布58目前五十八页\总数七十页\编于八点RNA提取注意事项制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;

抗高温严寒(0-65℃均具活性）

抗变性剂59目前五十九页\总数七十页\编于八点RNA提取注意事项体内RNase样品取材要新鲜，并且在液氮或-70℃冰箱中冻存。RNA提取试剂的选择，TRIzolReagent或试剂盒。匀浆器或是研钵；破碎细胞要快速；尽量在低温下进行。体外RNase空气中的RNase试剂中带有的RNase实验耗材实验者本身60目前六十页\总数七十页\编于八点解决办法：

外源RNase—高温，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液，（Tris·HCl除外）和器皿，操作者带手套

内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等

61目前六十一页\总数七十页\编于八点DEPC有刺激性，对眼睛气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。高温高压121℃，15min，DEPC即降解成二氧化碳和水62目前六十二页\总数七十页\编于八点总RNA的提取与纯化

一般流程：

1、样本前处理2、细胞裂解释放RNA

3、RNA的纯化及获得4、RNA质量检测

63目前六十三页\总数七十页\编于八点样品前处理新鲜血液，不超过4小时新鲜的幼嫩组织生长旺盛期的细胞生长旺盛的新鲜组织64目前六十四页\总数七十页\编于八点细胞裂解释放RNA异硫氰酸胍/酚－TRIzol总RNA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒独特配方--RNAplant植物RNA提