基因工程基因工程的载体

（优选）基因工程基因工程的载体目前一页\总数一百七十六页\编于八点Office:Room409ofExperimentBuildingNo.3

:06358230050,

:glzhou@:448953745Instructor:GuoLiZHOUAssociateProfessor,Ph.D.UniversityofLiaocheng,Liaocheng,CHN基因工程的载体第3章

目前二页\总数一百七十六页\编于八点Generalizedoverviewofcloningstrategies,withfavouredroutesshownbyarrows.333*目前三页\总数一百七十六页\编于八点CONTENTS质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体Specialistpurposevectors4目前四页\总数一百七十六页\编于八点重点与难点内容质粒载体的基本特性、图谱识别及应用噬菌体载体的特性、类型、及应用其它类型载体的特性及其应用克隆载体与表达载体组成及区别5重点各种载体的选择方法及应用难点目前五页\总数一百七十六页\编于八点

遗传物质

+载体

重组的DNA分子

引入细胞或生物体内

复制与表达

稳定地遗传给下代引言6目前六页\总数一百七十六页\编于八点

1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区（encodingregion)和终止子（terminator)的基因，or组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的；

2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。DNA7目前七页\总数一百七十六页\编于八点载体（vector)是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一种遗传成分；基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体。载体的概念8目前八页\总数一百七十六页\编于八点载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的功能9目前九页\总数一百七十六页\编于八点

A、复制起点：能在受体中复制；B、筛选标记；C、限制性内切酶切割位点；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、适当的拷贝数；F、载体的安全性：质粒不能随便转移;G、外源基因的表达：启动子。载体的要求10目前十页\总数一百七十六页\编于八点按功能分类克隆载体克隆一个基因或DNA片断表达载体用于一个基因的蛋白表达整合载体把一个基因插入到染色体组中按来源分类质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体载体的分类11目前十一页\总数一百七十六页\编于八点载体的种类和特征质粒*受体细胞结构插入片断举例

E.coli环状＜

8kbpUC18/19,T-载体等

λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状＜

10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体＞

1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒12目前十二页\总数一百七十六页\编于八点1.质粒载体13*Whatareplasmids?目前十三页\总数一百七十六页\编于八点1.1质粒的一般生物学特性Plasmidsareextrachromosomageneticelementsthatarenotessentialforbacteriatosurvivebutoftenconferadvantageoustraits(suchasantibioticresistance)onthehostcell.14定义：染色体之外的遗传物质,可自主复制并稳定遗传*Whatareplasmids?目前十四页\总数一百七十六页\编于八点1.1质粒的一般生物学特性15常见于原核细菌和真菌中,某些蓝藻、真菌和绿藻中也有发现*绝大多数的是DNA（除了酵母的杀伤质粒（killerplasmid）是一种RNA质粒外）化学本质来源目前十五页\总数一百七十六页\编于八点1.1质粒的一般生物学特性16对细菌的存活非必须，但常具有某些有利性状（如抗生素抗性）*绝大多数为cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA，共价、闭合、环状DNA分子），极少的天然质粒是线状的结构性质目前十六页\总数一百七十六页\编于八点质粒的各种表型质粒在原核生物中分布广泛，大小不一，从1-200kb不等，通常非宿主所必需。常具有各种特殊表型，表中已列出，如抗生素抗性、糖酵解、重金属抗性、诱导植物肿瘤等等。17目前十七页\总数一百七十六页\编于八点18目前十八页\总数一百七十六页\编于八点Plasmidsarerepliconswhicharestablyinheritedinanextrachromosomalstate.191.2ThreeConformations（三种构型）染色体之外的可稳定遗传的复制子，多数为环状dsDNA分子Q：什么叫复制子？目前十九页\总数一百七十六页\编于八点双链完整，则为cccDNA(共价闭合环状DNA)双链中只有一条完整，则为开环DNA(OCDNA)Mostplasmidsexistasdouble-strandedcircularDNAmolecules.IfbothstrandsofDNAareintactcirclesthemoleculesaredescribedascovalentlyclosedcirclesorcccDNA.Ifonlyonestrandisintact,thenthemoleculesaredescribedasopencirclesorOCDNA.20目前二十页\总数一百七十六页\编于八点21松弛的cccDNA开环的DNA(ocDNA)超螺旋DNA(scDNA)DNA旋转酶拓扑异构酶内切酶内切酶DNA连接酶在天然状态下，噬菌体Ф×174RF2的DNA就是开环DNA的形式。目前二十一页\总数一百七十六页\编于八点*三种构型22目前二十二页\总数一百七十六页\编于八点同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。开环DNA(ocDNA)多数是在提取过程中或其他原因使超螺旋DNA(scDNA)分子上一条链被打断而形成一个切口，此时超螺旋DNA松开形成开环DNA分子。即使它们原系同一分子，但因其状态不同，如L(线状DNA)，OC，SC的区别，在凝胶电泳时的迁移率也不相同。ocDNA在电泳时通常跑得最慢。*三种构型23目前二十三页\总数一百七十六页\编于八点1.3分类:结合型和非结合型两种Plasmidscanbecategorizedintooneoftwomajortype–conjugativeornon-conjugative–dependinguponwhetherornottheycarryasetoftransfergenes,calledthetragenes,whichpromotebacterialconjugation.

根据是否带有一套的转移基因（tra）可分为结合型和非结合型两种Tra基因可促使细菌发生结合24目前二十四页\总数一百七十六页\编于八点25目前二十五页\总数一百七十六页\编于八点TraproteinfromconjugativeplasmidbomsiteMobgenemobmRNAMobproteinopenrecipientcellhelperplasmid即mob基因的产物可打开非接合质粒的oriT位点，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。质粒的可转移性26目前二十六页\总数一百七十六页\编于八点R质粒因同时具有tra和mob，可以进行接合和转移ColE1因仅有mob，没有tra，所以仅能进行转移，而不能接合。它只能通过F或F类似的质粒进行接合和转移。27目前二十七页\总数一百七十六页\编于八点如果tra和mob都缺失，不能接合，也不能转移。如果缺失了一部分的mob，且缺失的部分仅与转移蛋白的拷贝有关，可通过另一组基因nic/bom来代偿。顺式作用元件nic/bom不会与其它质粒发生交换，因此从生物安全的角度看，非接合质粒是安全的。这是它作为载体的第一个有利条件。非接合质粒的高拷贝是人工构建载体的第二个有利条件！28目前二十八页\总数一百七十六页\编于八点1.3分类:松弛型和严紧型两种Plasmidscanalsobecategorizedonthebasisoftheirbeingmaintainedasmultiplecopiespercell(relaxedplasmids)orasalimitednumberofcopiespercell(stringentplasmids).质粒拷贝数：即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。29还可根据每个细胞中质粒拷贝数的多寡分为两类：松弛型和严紧型。*目前二十九页\总数一百七十六页\编于八点Generally,conjugativeplasmidsareofrelativelyhighmolecularweightandarepresentasonetothreecopiesperchromosome,whereasnon-conjugativeplasmidsareoflowmolecularweightandpresentasmultiplecopiesperchromosome.AnexceptionistheconjugativeplasmidR6K,whichhasamolecularweightof25×106daltonsandismaintainedasarelaxedplasmid.30严紧型质粒(stringentplasmids)：alimitednumberofplasmidcopiespercell。接合型质粒，分子量大，低拷贝数，1－3拷贝（质粒R6K例外）松弛型质粒（relaxedplasmid）：Relaxedplasmidsareplmidswithmultiplecopiespercell。非接合型质粒，分子量小，高拷贝数，10－60拷贝，不会自行接合转移，较安全目前三十页\总数一百七十六页\编于八点1.4INCOMPATIBILITYOFPLASMIDS

(质粒的不相容性)质粒的不相容性:在没有选择压力的情况下，任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能在同一宿主细胞内稳定的共存的现象。31不相容性质粒：不能共存于同一细胞内的不同质粒相容性质粒：可以共存于同一细胞内的不同质粒Plasmidincompatibility

istheinabilityoftwodifferentplasmidstocoexistinthesamecellintheabsenceofselectionpressure.ThetermincompatibilitycanonlybeusedwhenitiscertainthatentryofthesecondplasmidhastakenplaceandthatDNArestrictionisnotinvolved.目前三十一页\总数一百七十六页\编于八点MOLECULARMECHANISM

（质粒不相容性的分子机制）两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内32两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势*不相容性相容性目前三十二页\总数一百七十六页\编于八点HOSTRANGEOFPLASMIDSThehostrangeofaplasmidisdeterminedbyitsoriregion.PlasmidswhoseoriregionisderivedfromplasmidColE1havearestrictedhostrange:theyonlyreplicateinentericbacteria,suchasE.coli,Salmonella,etc.OtherpromiscuousplasmidshaveabroadhostrangeandtheseincludeRP4andRSF1010.Plasmidswithabroadhostrangeencodemost,ifnotall,oftheproteinsrequiredforreplication.Theymustalsobeabletoexpressthesegenesandthustheirpromotersandribosomebindingsitesmusthaveevolvedsuchthattheycanberecognizedinadiversityofbacterialfamilies.33不同的质粒有不同的宿主，但这都取决于质粒的复制起始位点。来源于ColE1质粒的复制起始位点ori，决定了这种质粒的宿主只能是肠道来源的细菌。而宿主范围广泛的质粒，则必须能表达多种蛋白才能适应不同的宿主。*目前三十三页\总数一百七十六页\编于八点PROTEINSENCODEDBYPLASMIDSPlasmidsencodeonlyafewoftheproteinsrequiredfortheirownreplicationandinmanycasesencodeonlyoneofthem.Alltheotherproteinsrequiredforreplication,e.g.DNApolymerases,DNAligase,helicases,etc.,areprovidedbythehostcell.Thosereplicationproteinsthatareplasmid-encodedarelocatedveryclosetotheori(originofreplication)sequencesatwhichtheyact.Thus,onlyasmallregionsurroundingtheorisiteisrequiredforreplication.Otherpartsoftheplasmidcanbedeletedandforeignsequencescanbeaddedtotheplasmidandreplicationwillstilloccur.Thisfeatureofplasmidshasgreatlysimplifiedtheconstructionofversatilecloningvectors.34质粒本身编码的蛋白相当少，许多与复制有关的蛋白都由宿主提供；质粒自身编码的与复制有关的蛋白则紧邻复制起点ori；由于与质粒复制有关的序列都在ori附近区域，其他部位则可删除或替换成其他基因，这非常有利于克隆载体的构建。*目前三十四页\总数一百七十六页\编于八点1.6质粒载体的选择Anidealcloningvehiclewouldhavethefollowingfourdesirableproperties（载体应具备的基本条件）35Replicationoriginisalsoessential.(复制起始位点)—（质粒本身就具备这一特征。）Areasonablyhighcopynumber(高拷贝数）*lowmolecularweight(低分子量);abilitytoconferreadilyselectablephenotypictraitsonhostcells（筛选标记）;singlesitesforalargenumberofrestrictionendonucleases,preferablyingeneswithareadilyscorablephenotype.（大量的内切酶酶切位点；多克隆位点，它们应该位于某选择性标志中）目前三十五页\总数一百七十六页\编于八点1.6质粒载体的选择36*以增殖外源序列为目的（结构上主要为载体本身必需的序列，分子量较小）以表达外源序列为目的（结构上多了一些与外源基因转录、翻译有关的序列，分子量较大）克隆载体表达载体目前三十六页\总数一百七十六页\编于八点表达质粒载体是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核细胞表达载体37目前三十七页\总数一百七十六页\编于八点38目前三十八页\总数一百七十六页\编于八点表达载体与克隆载体的区别强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因有效的转录在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白质翻译在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性39目前三十九页\总数一百七十六页\编于八点表达型载体（expressionvector）

特点基因的启动子序列和终止子序列一般无检测标记基因克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。结构转化单元--宿主细胞转化表达单元--外源基因表达40目前四十页\总数一百七十六页\编于八点表达型载体（expressionvector）显然,不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定,表达载体的类型也就确定了。用途表达外源基因以产生大量外源基因产物用于构建cDNA文库41目前四十一页\总数一百七十六页\编于八点THEADVANTAGESOFALOWMOLECULARWEIGH

（低分子量的优点）Theplasmidismucheasiertohandle,i.e.itismoreresistanttodamagebyshearing,andisreadilyisolatedfromhostcells.（易处理，如抵抗物理剪切力强，易从宿主中分离提取）Low-molecular-weightplasmidsareusuallypresentasmultiplecopies,andthisnotonlyfacilitatestheirisolationbutleadstogenedosageeffectsforallclonedgenes.（多为多拷贝形式，这样利于提取）Withalowmolecularweightthereislesschancethatthevectorwillhavemultiplesubstratesitesforanyrestrictionendonuclease.(分子量低，则内切酶识别位点少)42转化效率与质粒DNA分子大小相关，小分子量的质粒转化率高；质粒克隆载体分子量小，可承载较大的外源DNA片断。目前四十二页\总数一百七十六页\编于八点多克隆位点（MCS）Polylinkerormultiplecloningsites(MCS)isashortDNAsequence,carryingsitesformanydifferentrestrictionendonulceases.（载体上人工构建的。一段短的DNA序列，携带有许多不同限制性内切酶识别位点。）43*BycombiningthemwithinanMCS,thesitesaremadecontiguous,sothatanytwositeswithinitcanbecleavedsimultaneouslywithoutexcisingvectorsequences.AnMCSincreasesthenumberofpotentialcloningstrategiesavailablebyextendingtherangeofenzymesthatcanbeusedtogeneratearestrictionfragmentsuitableforcloning.目前四十三页\总数一百七十六页\编于八点44Fig.MapofplasmidpUC18.(b)Thepolylinkerregion.Thishasmultiplerestrictionsitesimmediatelydownstreamfromthelacpromoter(Plac).Thein-frameinsertusedtocreatetheMCSishatched.PlasmidpUC19isidenticalwithpUC18apartfromtheorientationofthepolylinkerregion,whichisreversed.Whataremeans?目前四十四页\总数一百七十六页\编于八点1.6.1第一个用于基因克隆的天然质粒PSC101野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建451973年，世界上第一例有目的的重组实验所采用的质粒载体pSC101目前四十五页\总数一百七十六页\编于八点天然质粒的缺陷？（1）分子量大，拷贝数低，酶切位点少第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子量9.1kb。但只有一个EcoRI切点充当克隆位点，Tetr作为筛选标志。（2）筛选标志不理想ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicinE1）。colicinE1能杀死不含ColE1质粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部。因此可通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicinE1的细胞.46目前四十六页\总数一百七十六页\编于八点人工改造的克隆载体PBR322及插入失活原理47pBR322是经人工改造的一种较为理想的大肠杆菌质粒载体，应用最为广泛。现在已经被许多更优良的新型克隆载体所替代。分子量在历次的改造中有一定的变化（4362~4363~4361）“p”表示它是一种质粒；

“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F．Bo1ivar和姓氏的头一个字母，

“322”系指实验室编号，以与其他质粒载体如pBR325，pBR327，pBR328等相区别。Innamingplasmids,pisusedtodesignateplasmid,andthisisusuallyfollowedbytheinitialsoftheworker(s)whoisolatedorconstructedtheplasmid.

Numbersmaybeusedtoclassifytheparticularisolate.目前四十七页\总数一百七十六页\编于八点48ConstructionofpBR322involvedaseriesofmanipulationstogettherightpiecesofDNAtogether,withthefinalresultcontainingDNAfromthreesources.目前四十八页\总数一百七十六页\编于八点THEPEDIGREEOFPBR322(PBR322的谱系)491）复制起始位点：源于ColE1衍生质粒pMB1。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多也是由这少数几个野生型质粒构建的。2）Apr基因：源于pSF2124质粒转座子Tn3。3）Tcr基因：源于pSC101质粒。目前四十九页\总数一百七十六页\编于八点AsummaryoftheoriginsofpBR322.

50目前五十页\总数一百七十六页\编于八点PBR322的筛选方式：

INSERTIONALINACTIVATION（插入失活）其中有7种限制酶：EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI,XmaIII和NruI，它们的识别位点是位于四环素抗性基因内部，另外有2种限制酶：ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr基因的失活；51还有3种限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨苄青霉素抗性基因（ampr）内具有单一的识别位点，在这个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。*这种因DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。目前五十一页\总数一百七十六页\编于八点52当外源DNA片段插入Tcr基因后，导致Tcr基因失活，使质粒变成只对Amp有抗性。或者外源基因插入Ampr基因中，则会导致Ampr基因失活，这个质粒就变成只对Tc有抗性。这样通过对抗生素的双抗或单抗来筛选是否有外源片段插入。筛选标记－插入失活*目前五十二页\总数一百七十六页\编于八点1.6.2PUC18/19(ALACselectionplasmid)

（PUC18/19和蓝白斑筛选原理）UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成.53pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19目前五十三页\总数一百七十六页\编于八点StructureofpUC18/19ori：来自pBR322质粒。Amprgene：来自pBR322质粒PromoteroflacZ：来自大肠杆菌lacZ’gene：大肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ

的氨基端片段54MCS（mutiplecloningsite,多克隆位点）：10个连续的单酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。目前五十四页\总数一百七十六页\编于八点pUC18/19与pBR322在结构上的主要差别在于：用乳糖操纵子的一个DNA片段（466bp）替换了pBR322选择标记Tcr

基因——于是筛选原理也不同（蓝白斑筛选）。此DNA片段含有乳糖操纵子的启动子、调节因子和β－半乳糖苷酶的α-肽基因。55Q：lac操纵子的结构？目前五十五页\总数一百七十六页\编于八点Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）：是-半乳糖苷酶的作用底物，无色，但酶解后可生成有色物质—5-溴-4-氯靛蓝IPTG：诱导物，与LacI的基因产物——阻遏蛋白结合，使之转变为无活性形式而不能与操作子结合，于是RNA聚合酶就能起始LacZ’基因的转录（肽）。56目前五十六页\总数一百七十六页\编于八点

Blue/White

Screening(蓝白斑筛选)Theactivityoftheenzymeβ-galactosidaseiseasily

monitoredbyincludinginthegrowthmediumthe

chromogenicsubstrate5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(X-gal).Thiscompoundiscolourless

butoncleavagereleasesablueindolylderivative.Onsolidmedium,coloniesthatareexpressingactive

β-galactosidaseareblueincolourwhilethosewithouttheactivityarewhiteincolour.Thisisoftenreferredtoasblue/whitescreening.SinceXgalisnotaninducerofb-galactosidase,thenon-substrate(gratuitous)inducerisopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)isalsoaddedtothemedium.57*目前五十七页\总数一百七十六页\编于八点蓝白斑筛选原理58插入了外源基因后，由于插入位置是LacZ’基因的5’端，基因结构被破坏，则不能产生肽，于是没有活性的-半乳糖甘酶，X-gal也不被水解，底物就仍为白色。重组菌落就是白色，非重组菌就是蓝色。—所谓蓝白斑筛选。没插入外源序列时，诱导物IPTG与LacI的基因产物——阻遏蛋白结合，使之转变为无活性形式而不能与操作子结合，

LacZ’基因正常转录表达，产生的肽与宿主细胞产生的-半乳糖甘酶的C端部分互补，形成有活性的四聚体结构的β半乳糖苷酶，可将底物X-gal水解，产生蓝色化合物。载体上：LacZ’基因（carryingtheN-terminal

fragmentofthelacZgene，编码-半乳糖甘酶的N端部分，肽，146aa）。宿主：lacZ基因缺陷型，只表达-半乳糖甘酶的C端部分*目前五十八页\总数一百七十六页\编于八点-Complementation(—互补)pUC质粒结构中的lacZ’基因所编码的—肽链（是β-半乳糖苷酶基因的N端末端）可参与-互补作用。这种载体适合于可编码β—半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然质粒和宿主编码的片段各自均无活性，但它们共处一个细胞中时可融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这种使LacZ基因缺失各一部分突变体的互补，叫做α-互补。59*目前五十九页\总数一百七十六页\编于八点IPTG诱导的结果：MCS无外源基因插入时，互补，产生蓝色菌斑。（说明蓝色代表非重组子）MCS有外源基因插入时，不互补，产生白色菌斑。（说明白色代表重组子）60通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。*温馨提示：南开大学曾考过相关的考研题目！目前六十页\总数一百七十六页\编于八点1.6.3T

Vector（T载体和TA克隆原理）现象：普通的Taq酶会自动给PCR产物的3’末端添加一个A。原理：普通的Taq酶能够在PCR产物3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的线性载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体MCS中。操作最简单，快速和高效，是Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法由Invitrogen公司（SanDiego，CA）发展而来的商业性试剂盒，用于PCR产物的克隆和测序。61*目前六十一页\总数一百七十六页\编于八点1.6.3T

VECTOR（T载体和TA克隆原理）62*TA克隆的优点不需使用含限制酶序列的引物；不需把PCR产物做平端处理；不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。

目前六十二页\总数一百七十六页\编于八点PMD18-T图谱63目前六十三页\总数一百七十六页\编于八点PSK-T载体图谱pSK-Tvector两侧的3`端，具有突出的碱基T，可以和PCR产物3’末端的A碱基互补，从而大大提高PCR产物的连接、克隆效率。可通过α互补的颜色反应来筛选重组子64目前六十四页\总数一百七十六页\编于八点PUC18-T克隆载体图谱65目前六十五页\总数一百七十六页\编于八点1.6.4TIPlasmid(TI质粒与植物基因工程)Ti（tumor-inducingplasmid）质粒：根癌农杆菌含有一种内源质粒，大小因种类而异，在200－250kb之间。当农杆菌同植物接触时，Ti质粒中有一段DNA，大约在15kb-30kb，称为T-DNA（transferred-DNA），能转移并整合到植物基因组中，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。66*目前六十六页\总数一百七十六页\编于八点1.6.4TIPlasmid(TI质粒与植物基因工程)67章鱼碱型胭脂碱型农杆碱型农杆菌素型琥珀碱型根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类，Ti质粒进行分类*由于载体上还会有其他与翻译有关的基因构建，因此Ti质粒是一种表达载体。目前六十七页\总数一百七十六页\编于八点冠瘿瘤和根癌农杆菌68上：电镜下的根癌农杆菌右：冠瘿瘤把瘤组织培养在不加生长素和细胞分裂素的培养基上，能够无限制的分裂和生长。目前六十八页\总数一百七十六页\编于八点TI质粒分为4个功能区：Con区：与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移

Ori区：Ori区上的基因调控Ti质粒的自我复制。69Vir区上的基因能激活T-DNA转移，使根癌农杆菌表现出毒性*从Ti质粒上被切割下来转移到植物细胞的一段DNA，含有编码植物激素（生长素）和冠瘿碱的基因Vir区T－DNA区目前六十九页\总数一百七十六页\编于八点章鱼碱型pTiAch5和胭脂碱型pTic58质粒基因图70T－DNA区Vir区Ori区Con区目前七十页\总数一百七十六页\编于八点T-DNACompleteTi-plasmidDNAisnotfoundinplanttumourcellsbutasmall,specificsegmentoftheplasmid,about23kbpinsize,isfoundintegratedintheplantnuclearDNAatanapparentlyrandomsite.ThisDNAsegmentiscalledT-DNA(transferredDNA).Itcarriesgenesthatconferbothunregulatedgrowthandtheabilitytosynthesizeopinesuponthetransformedplanttissue.However,thesegenesarenon-essentialfortransferandcanbereplacedwithforeignDNA.71Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约23kb。能转移到植物细胞内的这一小段DNA片段称为T－DNA（transferred-DNA）*目前七十一页\总数一百七十六页\编于八点BORDERSEQUENCE(边界序列)IntheTiplasmiditself,theT-DNAisflankedby25bpimperfectdirectrepeatsknownasbordersequence.T－DNA左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列(左边界(leftborder,LB)，右边界(rightborder,RB))，在不同Ti质粒中高度保守。它在T-DNA的切除及整合过程具有重要意义。右边界的存在对外源基因整合到植物基因组中相当重要，但左边界则非必须。DeletionoftherightborderrepeatabolishesT-DNAtransfer,buttheleft-handbordersurprisinglyappearstobenon-essential.72*目前七十二页\总数一百七十六页\编于八点BORDERSEQUENCE(边界序列)73边界序列对T－DNA转移和整合不可缺少；已证实只要保留两端边界序列，虽然中间序列不同程度被外源片断所替换，仍可转移整合到植物基因组中－Ti质粒遗传转化的理论依据。*目前七十三页\总数一百七十六页\编于八点TI质粒作为转基因载体的缺陷转化后会产生植物激素，阻碍转化细胞的再生（因此这部分基因序列要删除）；冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不大（因此这部分基因序列也要删除）；Ti质粒长约200-800kb，过于庞大（因此要删除部分无关紧要的序列）；Ti质粒不能在大肠杆菌中复制（因此要增加大肠杆菌的复制起始位点）。左右边界序列要保留。74目前七十四页\总数一百七十六页\编于八点75目前七十五页\总数一百七十六页\编于八点76目前七十六页\总数一百七十六页\编于八点(一）Ti质粒的改造-双元载体系统（binaryvetor）又叫二元载体系统，是指农杆菌中用于把T-DNA区域转入受体细胞的双质粒系统。其中一个质粒带有毒性基因，另一质粒带有改造过的T-DNA区域，用于携带外源基因。77双元载体系统目前七十七页\总数一百七十六页\编于八点双元表达载体系统主要包括两个部分一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。另一部份是微型Ti质粒(Mini-Tiplasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及LacZ基因等。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA的转移。与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。78目前七十八页\总数一百七十六页\编于八点双元表达载体系统主要包括两个部分79目前七十九页\总数一百七十六页\编于八点80目前八十页\总数一百七十六页\编于八点81目前八十一页\总数一百七十六页\编于八点（二）TI质粒的改造—共整合载体系统指含有目的基因的中间表达载体与改造后的受体Ti质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常又称为共整合载体(co-integratedvector)；由于该载体的T-DNA区与Ti质粒Vir区连锁，因而又称为顺式载体(cis-vector)。

82共整合载体目前八十二页\总数一百七十六页\编于八点基本原理—共整合载体系统先通过pBR322插入一段T-DNA区段构建中间载体，克隆目的基因。再将含有中间载体的大肠杆菌与含有Ti质粒的农杆菌进行细胞融合，两个质粒通过T-DNA的同源区段发生同源重组，最后在农杆菌内得到Vir共整合的Ｔi质粒载体。83目前八十三页\总数一百七十六页\编于八点构建过程—共整合载体系统一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体(如pBR322质粒)中插入了一段合适的T-DNA片段而构成的小型质粒。84中间载体目前八十四页\总数一百七十六页\编于八点构建过程—共整合载体系统1）中间载体的表达构建在中间载体中加上能在植物细胞中表达的各种启动子，可使外源基因在植物细胞中表达；当启动子与显性选择标记基因及报告基因连接，构成嵌合基因(chimericgene)时，这些标记基因同样能表达，从而可提供用于筛选和鉴定的表型。这类含植物启动子的中间载体称为中间表达载体(intermediateexpressionvector)。85目前八十五页\总数一百七十六页\编于八点2）植物表达载体的构建中间表达载体是不能将外源基因转化进植物细胞。因此，必须将中间表达载体引入到上述已改造的受体Ti质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体(它是由两种以上质粒构成的复合型载体，故称之为载体系统)，才能在植物基因转化中应用。86目前八十六页\总数一百七十六页\编于八点为利用根癌农杆菌的Ti质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统。一元载体系统是指首先将目的基因插入到中间表达载体上，筛选出含有目的基因的重组分子，然后将重组质粒转化到根癌农杆菌中，重组质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子就可整合到植物细胞染色体DNA上。最后利用植物选择标记基因筛选转化细胞。

87目前八十七页\总数一百七十六页\编于八点88目前八十八页\总数一百七十六页\编于八点89目前八十九页\总数一百七十六页\编于八点90目前九十页\总数一百七十六页\编于八点植物表达载体PCAMBIA1300图谱91质粒载体左边界右边界植物标记基因，MCS质粒载体卡那霉素抗性基因潮霉素抗性基因来源于CaMV的启动子左边界右边界在大肠杆菌中的复制起点目前九十一页\总数一百七十六页\编于八点右边界左边界大肠杆菌的复制起点Gus基因（报告基因）92目前九十二页\总数一百七十六页\编于八点CAMV35S启动子是植物基因工程中常用来构建表达载体的一个启动子序列来自花椰菜花叶病毒，由于启动整个CaMV基因组的一小段重叠序列转录产物的沉降系数为35S，故将编码该转录产物的启动子称之为35S启动子。该启动子包括TATA盒、CAAT盒、倒转重复序列和增强子核心序列（GTGG/TTTG）。CaMV35S启动子加上来自AMV（苜蓿花叶病毒）的一段44bp的引导序列，可使其表达强度增加5倍（44bp序列是翻译增强序列）。将加倍的CaMV35S启动子与AMV引导序列结合构成一个复合串联启动子，比未修饰的启动子表达增强20倍。93目前九十三页\总数一百七十六页\编于八点其他类型的启动子马铃薯块茎特异蛋白基因启动子小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（ADPG-lucosepyrphosphorylase)启动子番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturnase)启动子花粉特异表达基因启动子（lat52）木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因(pal)启动子94目前九十四页\总数一百七十六页\编于八点报告基因是标记基因的一种。通常其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因，不需要依赖外界的压力。常见的有：1、绿色荧光蛋白基因（GFP，greenfluorescenceprotein）2、β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS基因，β-D-glucuronidase）3、荧光素酶基因（LUC，fireflyluciferase）4、氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因）95*目前九十五页\总数一百七十六页\编于八点报告基因必须具备的条件有：(1)已被克隆和全序列已测定;

(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;

(3)

报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好，表达产物能进行定量测定；(4)

细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测

96目前九十六页\总数一百七十六页\编于八点JELLYFISHAEQUOREAVICTORIA:ONEOFTHEOLDESTSPECIESONTHEEARTH97目前九十七页\总数一百七十六页\编于八点绿色荧光蛋白（GFP）GFP的首个重大改变是钱永健在1995年完成。GFP的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488nm，而发射峰仍保持在509nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。98Heim,R.,Cubitt,A.B.,&TsienR.Y.Improvedgreenfluorescence.Nature.1995Feb23;373(6516):663-4.*目前九十八页\总数一百七十六页\编于八点99GFP标记的微管表达绿色荧光蛋白的线虫目前九十九页\总数一百七十六页\编于八点GUS基因GUS基因就是β-葡萄糖苷酸酶基因。该基因产物为β-葡萄糖苷酸酶，是一种水解酶，相当稳定而不易降解。测定方法非常简单，且可使用底物

在原位显现出酶的活性，以肉眼即可检测其产物，非常方便。常用的组织化学方法检测GUS基因的表达：以无色的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若该组织细胞含有gus基因且有表达，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织、甚至单个细胞内的表达情况.100*目前一百页\总数一百七十六页\编于八点用GUS活性检测转基因拟南芥A：组成型启动子CaMV35S的转基因拟南芥

B：根特异性启动子PsMTA的转基因拟南芥

101目前一百零一页\总数一百七十六页\编于八点转基因烟草萌发花粉的GUS组织化学染色CK-102目前一百零二页\总数一百七十六页\编于八点GUS基因组织化学染色35S-茎横切CK-茎横切103目前一百零三页\总数一百七十六页\编于八点选择基因（筛选标记基因）也是标记基因的一种。选择基因（又称选择标记基因或筛选标记基因），其编码产物可使抗生素或除草剂失活。这种基因在执行其选择功能时，通常存在检测慢（蛋白酶作用需要时间）、依赖外界筛选压力（如抗生素、除草剂）等缺陷。主要是各种抗生素抗性基因、使除草剂失活的基因104*目前一百零四页\总数一百七十六页\编于八点其他载体穿梭质粒载体（shuttleplasmidvecotr）人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、因此可以在两种不同的寄主细胞中复制和存活的质粒载体。105大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌动物细胞穿梭载体目前一百零五页\总数一百七十六页\编于八点2.噬菌体载体2.1λvector2.2M13vector106目前一百零六页\总数一百七十六页\编于八点2.1λVECTOR（

λ

载体）TheDNAofphageλ,intheforminwhichitisisolatedfromthephageparticle,isalinearduplexmoleculeofabout48.5kbp.线性双链DNA分子，长度为48.5kb(48502bp);蛋白质外壳1982年由Sanger等完成测序107高效率高特异性侵染宿主细胞(这种高感染性能使外源基因高效导入受体细胞)自主复制繁殖性能使外源基因在宿主细胞中高效扩增噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为目前一百零七页\总数一百七十六页\编于八点2.1.1COSSITE(COS位点,科斯位点)Ateachendofphageλareshortsingle-stranded5’projectionsof12nucleotides,whicharecomplementaryinsequenceandbywhichtheDNAadoptsacircularstructurewhenitisinjectedintoitshostcell,i.e.λDNAnaturallyhascohesivetermini,whichassociatetoformthecossite.在λDNA分子两端各有12nt的单链5’粘性末端，且两者的核苷酸序列互补，当λ噬菌体进入细菌细胞后，其DNA可迅速通过粘性末端互补配对而成双链环状DNA分子，这种由噬菌体粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点（cohesiveendsite）108*目前一百零八页\总数一百七十六页\编于八点109目前一百零九页\总数一百七十六页\编于八点2.1.2LIFECYCLEOFPHAGEλcos连接成环后，噬菌体与宿主细胞进行位点特异性重组，将自身基因组重组到宿主染色体中，随宿主染色体的复制而复制；110*cos连接成环后DNA双向复制，复制到后期变成滚环复制形式大量增殖DNA，头部蛋白大量表达，同时将DNA切割成一个个单独λ基因组后包装进成熟的噬菌体头部，尾部蛋白加到头部形成成熟的噬菌体，最后裂解宿主细胞。溶菌周期溶源周期目前一百一十页\总数一百七十六页\编于八点Replicationofphage-λDNAinlyticandlysogeniccycles.111目前一百一十一页\总数一百七十六页\编于八点112目前一百一十二页\总数一百七十六页\编于八点天然的它作为载体的两个难题，怎么办呢？113目前一百一十三页\总数一百七十六页\编于八点2.1.3GENOMEOFPHAGEλ

114目前一百一十四页\总数一百七十六页\编于八点115左臂：从A到J长约20kb，编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。要保留中段(J-N)：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列，但非裂解生长所必需。可删除右臂(N-R)：长约10kb，与调控、DNA合成、免疫、后期功能控制、宿主细胞裂解有关。要保留目前一百一十五页\总数一百七十六页\编于八点天然的它作为载体的两个难题，解决啦！116利用λ噬菌体作载体，主要是将外源基因替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的裂解（溶菌）繁殖而繁殖。设计去除λDNA上的多余序列和一些限制性酶切点：因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。Thetechniqueofmutagenesisinvitromaybeusedtomodifyremainingsitesthatarenotrequired.目前一百一十六页\总数一百七十六页\编于八点

phageλcanaccommodateonlyabout5%morethanitsnormalcomplementofDNA.λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限：正常野生型DNA总量的105％左右，下限：正常野生型DNA总量的75％。117*2.1.4Capacityofλvector（λ噬菌体的容量）λ噬菌体的容量范围：75%~105%目前一百一十七页\总数一百七十六页\编于八点按野生型λDNA分子长度为48.5kb计算，λ噬菌体的包装上限是51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。118*2.1.4Capacityofλvector（λ噬菌体的容量）理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有效的克隆范围仅为15kb左右。但在一般的情况下，15kb左右大小的DNA片段已足够容纳一个完整的基因及其两端的侧翼序列。目前一百一十八页\总数一百七十六页\编于八点2.1.5TYPEOFλVECTOR119只具有一个限制酶位点，可便于外源DNA插入的称为插入型载体，i.e.λgt10，λgt11插入型载体（insertionalvectors）置换型载体（replacementvector）含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代，i.e.λEMBL3、λEMBL4）MostofthesevectorswereconstructedforusewithEcoRI,BamHIorHindIII,buttheirapplicationcouldbeextendedtootherendonucleasesbytheuseoflinkermolecules.*目前一百一十九页\总数一百七十六页\编于八点Inλgt10(43.3kb)thisgeneratesleftandright‘arms’of32.7and10.6kb,respectively,whichcanintheoryacceptinsertDNAfragmentsuptoapproximately7.6kbinlength.插入型载体:

λgt10andCharon16A120目前一百二十页\总数一百七十六页\编于八点EMBL4(41.9kb)hasacentral13.2kbstufferfragmentflankedbyinvertedpolylinkersequencescontainingsitesfortherestrictionenzymesEcoRI,BamHI,andSalI.TwoSalI

sitesarealsopresentinthestufferfragment.置换型载体:EMBL4andCharon40121目前一百二十一页\总数一百七十六页\编于八点2.2M13VECTOR（

M13噬菌体载体）122M13、f1和fd，是一类丝状大肠杆菌噬菌体，它们都含有长度为6.4kb、彼此具有很高同源性的单链环状DNA分子。由外壳包装蛋白和正链DNA(+ssDNA)组成。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。目前一百二十二页\总数一百七十六页\编于八点LIFECYCLEOFM13LifecycleandDNAreplicationofphageM13.123M13吸附并通过大肠杆菌的雄性鞭毛内孔注入其+ssDNA，以+ssDNA为模板合成-DNA，形成dsDNA（RFDNA）；再以-DNA为模板滚环复制，拷贝数100-200时复制停止；编码基因表达出蛋白质，包装正链并分泌至体外；虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/2—3/4）目前一百二十三页\总数一百七十六页\编于八点ADVANTAGESOFM13VECTOR单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RFDNA（replicativeformDNA）。RFDNA很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。124目前一百二十四页\总数一百七十六页\编于八点ADVANTAGESOFM13VECTORRFcanbepurifiedandmanipulatedinvitrojustlikeaplasmid（在体外易于象质粒一样进行纯化和操作）bothRFandssDNAwilltransfectcompetentE.colicellstoyieldeitherplaquesorinfectedcolonies(筛选方便，可感染感受态大肠杆菌细胞。被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大)itisveryeasytodeterminetheorientationofaninsert.（很容易测定外源DNA片段的插入方向（因此被用于测序））Insummary,asvectors,filamentousphagespossessalltheadvantagesofplasmidswhileproducingparticlescontainingsingle-strandedDNAinaneasilyobtainableform.（总之，M13拥有所有质粒的好处，同时又能以一种很容易获得的形式产生包含ssDNA的颗粒）125但M13--DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb目前一百二十五页\总数一百七十六页\编于八点APPLICATIONOFM13VECTOR可产生大量纯化