免疫组织化学技术介绍

免疫组织化学技术

西南医院病理学研究所冯俊明免疫组织化学技术介绍第1页免疫组织化学（简称免疫组化）是组织化学一个，它是利用已知特异性抗体或抗原能特异性结合特点，经过化学反应使标识于结合后特异性抗体上显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定颜色，并借助显微镜观察其颜色改变，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构化学成份或化学性质。免疫组织化学技术介绍第2页近十年来，免疫组化技术发展很快，在当代医学基础和临床研究中发挥着主要作用，对疾病，尤其是对肿瘤诊疗、判别诊疗及发病机理研究提供了强有力伎俩，但伴随免疫组化标识物增多和利用，原为特异标识物并非绝对特异，而且出现交叉反应和异常表示情况日益增多。故对免疫组化标识结果意义不能绝对化，应在光镜观察组织形态基础上，合理使用免疫组化技术，审慎判断其标识意义。

免疫组织化学技术介绍第3页免疫组化标识形态学特征

免疫组化标识含有形态学特点，若能熟练掌握则有利于对免疫组化标识结果正确判断，现择要分述以下：

免疫组织化学技术介绍第4页一、阳性标识色度特征

免疫组化标识时细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标识方法及其敏感性。普通而言，抗原含量越多，分布密度越高，标识方法越敏感，阳性结果显色则越强。依据阳性标识显色程度分为：淡黄色，提醒为弱阳性；棕黄色，为中等度阳性；棕黑色，示为强阳性。在结果判断中，后二者较有意义，可作为判断依据。而前者除考虑标本处理和方法学原因外，可能与细胞只有轻度异常表示，或一些细胞摄取了周围组织抗原之故。

免疫组织化学技术介绍第5页免疫组织化学技术介绍第6页二、阳性标识细胞学特征

免疫组化标识中，阳性标识细胞学特征是反应抗原在细胞中定位和分布情况。在诊疗中阳性细胞以拟标识细胞为前提，阳性表示必须在细胞特定抗原部位，若不在抗原所在部位阳性表示和非目标细胞即使阳性也不应作为判断依据。依据抗原在细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位可分为以下5种类型：免疫组织化学技术介绍第7页1.胞膜型阳性颗粒主要分布于细胞膜表面，形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞。这类型常见于一些膜抗原，如上皮膜抗原（EMA）、白细胞共同抗原（LCA）及B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原（GAA）和Ki-1等。

免疫组织化学技术介绍第8页2.胞核型阳性颗粒定位于细胞核，呈均匀分布或位于核膜下，有呈小斑块状不规则分布。此多见于增殖细胞核抗原、Ki-67及激素受体中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和基因p53等。免疫组织化学技术介绍第9页免疫组织化学技术介绍第10页3.胞浆型阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗原均属于此种类型，如细胞角蛋白、波形蛋白、结蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶及前列腺特异性抗原（PSA）等。依据抗原在胞浆内分布形式，通常表现为弥漫性分布或不足分布。前者阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆。不足是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞浆中某一部位、核周或细胞浆一侧。免疫组织化学技术介绍第11页免疫组织化学技术介绍第12页4.微绒毛型抗原颗粒主要分布于腺癌细胞微绒毛，而胞浆和胞膜能够是阳性或阴性表示。这种表现形式最常见于各种腺癌，如甲状腺腺癌、乳腺腺癌、胃肠腺癌、胆道腺癌、卵巢浆液性腺癌等。其特点是阳性颗粒除靠近腔面阳性外，其余基底部可呈阴性反应。在肿瘤标识物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、结肠相关抗原、卵巢癌抗原等。甲状腺腺癌中甲状腺球蛋白常以该形式出现。免疫组织化学技术介绍第13页5.复合型在常规免疫组化标识中，同一个抗原能够同时表示于胞膜和胞浆、胞核和胞浆、微绒毛和胞浆，但极少发觉胞膜和胞核同时表示。值得注意是组织标本固定不及时造成抗原移位或乳腺ER和PR修复不充分也能够发生胞核和胞浆同时阳性。免疫组织化学技术介绍第14页三、阳性标识组织学特征

依据免疫组化阳性细胞组织学特点，免疫组化阳性细胞或阳性颗粒可呈以下类型排列：

免疫组织化学技术介绍第15页1.局灶型阳性细胞呈不规则小灶性分布。阳性细胞可多可少，排列不规则，无固定排列形式，阳性染色深浅不一。细胞角蛋白、上皮膜抗原在低分化鳞状细胞癌、腺癌和癌肉瘤；肌动蛋白和结蛋白在低分化横纹肌肉瘤；NSE、神经丝蛋白、突触素在恶性神经内分泌肿瘤及低分化星形胶质细胞瘤中胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）和恶性黑色素瘤中S-100蛋白等均可表现为局灶性阳性。

免疫组织化学技术介绍第16页免疫组织化学技术介绍第17页2.弥漫型阳性细胞呈弥漫性分布，细胞间无连接，也能够单个细胞散在分布。此型中细胞几乎都高度表示某种抗原，如淋巴瘤（白细胞共同抗原）、Hodgkin病（粒细胞相关抗原、Ki-1）、胃肠未分化癌癌胚抗原（CEA）及上皮膜抗原、尤文瘤中CD99等。免疫组织化学技术介绍第18页3.片块型较常见。阳性细胞多为细胞浆表示，细胞间界限较清楚，但相互融合呈片状或团块状结构。此型可见于上皮源性肿瘤、一些向上皮分化间叶源性肿瘤、恶性黑色素瘤、中分化神经内分泌瘤及核形细胞瘤（如癌肉瘤和神经纤维瘤、平滑肌肉瘤）。

免疫组织化学技术介绍第19页4.网状型此型主要见于细胞密度较大大细胞肿瘤，标识物多为膜抗原。阳性细胞膜与膜间相互紧靠，而胞核呈阴性反应，免疫组化标识显示网状结构。

免疫组织化学技术介绍第20页5.腺管型主要见于腺癌和含有腺癌样结构胚胎性肿瘤。上皮标识物多为胞浆表示。胃肠低分化腺癌中有时HE极难判别腺样结构，但用癌胚抗原、上皮膜抗原或结肠癌相关抗标准轻易显示出来。

免疫组织化学技术介绍第21页免疫组织化学技术介绍第22页6.腔缘型阳性颗粒主要位于腺癌腔缘微绒毛处，沿腺管腔缘表面内衬一薄层黄色颗粒，基底部多为阴性。结肠癌相关抗原在胃肠腺癌、胆囊腺癌、乳腺癌中常表现为这种类型；卵巢癌相关抗原在卵巢浆液性腺癌亦是如此；肿瘤相关粘液抗原在许多腺癌中也显示腔缘阳性。

免疫组织化学技术介绍第23页7.菊团型阳性肿瘤细胞排列呈菊团样结构，部分阳性细胞围绕血管排列。此型多见于分化很好神经内分泌肿瘤和胶质细胞瘤等，阳性颗粒定位在细胞浆。

免疫组织化学技术介绍第24页四、阳性标识强度特征

细胞免疫组化标识阳性强度依据显色程度分为弱阳性、中度阳性和强阳性；也可依据阳性细胞在细胞中所占百分比大致分为：弱阳性，阳性细胞≤25%；中阳性，阳性细胞25%~50%；强阳性，阳性细胞>50%。

免疫组织化学技术介绍第25页免疫组织化学技术介绍第26页五、非特异着色特征

以下情况可干扰免疫组化标识结果观察和判断：（1）抗体交叉反应：是因为该抗原决定簇同时存在于各种组织细胞，如GFAP可同时存在于星形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100蛋白则更为严重，可表示于各种组织细胞。所以，应全方面了解和认识该抗体功效和标识范围。故抗体交叉反应只要应用得当仍有利于诊疗。

免疫组织化学技术介绍第27页（2）肿瘤细胞异常表示：可选取各种标识去证实或排除，判别其真正组织起源或向某一组织细胞分化。（3）肿瘤细胞吞噬组织抗原：是因为一些恶性肿瘤细胞摄入周围正常组织细胞成份，即使后者也存在一些抗原，但不属于瘤细胞固有成份，胞浆内抗原定位较含糊，所以应该区分。免疫组织化学技术介绍第28页（4）非特异性染色是指抗原无明确定位，肿瘤细胞与间质细胞、细胞与间质均为黄色，相互累及一片，色度无深浅之分。这种标识组织片不能作为免疫组织标识结果判断依据。免疫组织化学技术介绍第29页非特异性染色原因常为组织标本固定不佳、抗体质量问题或稀释度不合理及操作方法不规范等。所以，免疫组化特异性染色定位非常主要，如前所述，阳性颗粒应位于细胞胞膜、胞浆或胞核，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。假如缺乏细胞间不均一性染色，即是呈阳性染色，常提醒为非特异性染色。另组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳性反应不能作为诊疗依据。免疫组织化学技术介绍第30页免疫组化结果判断标准及

对假阴性和假阳性认识

一、

免疫组化结果判断标准

免疫组化含有特异性强、敏感性高及定位正确等优点，但伴随免疫组化应用普及和深入，越来越多问题也随之出现。所以，掌握对免疫组化结果判断标准是很主要。免疫组织化学技术介绍第31页1.必须设染色对照每批染色都要以特异性阳性对照和阴性对照为基础，才能对染色结果做出正确判断。没有阳性对照，就不能做出真正阴性结果判断；同理，没有阴性对照，也就不能做出真正阳性结果判断。因而，没有对照免疫组化染色，即使做出了判断也是不可信。免疫组织化学技术介绍第32页2.抗原表示必须在特定部位阳性表示必须在细胞和组织特定抗原部位才能视为阳性，如LCA在细胞膜上、Keratin在细胞浆内、S-100蛋白在胞浆和胞核内，EMA在细胞膜上。不在抗原所在部位阳性表示一概不能视为阳性。

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3.阴性结果不能视为抗原不表示即阴性结果不能认为含有否定意义；阳性表示有强弱、多少之分，哪怕是只是有少数细胞阳性（但要在抗原所在部位）也要视为阳性表示，不能认为个别细胞阳性而不作阳性对待。

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4.免疫组化与HE切片诊疗应以HE切片诊疗为准当免疫组化诊疗结果与HE切片诊疗不一致时，应再结合临床资料、X线等影像学及试验室结果综合分析，不能用免疫组化检验结果推翻HE切片诊疗。

免疫组织化学技术介绍第35页二、引发假阴性和假阳性结果原因

1.假阴性结果原因主要是：（1）抗体已失活或浓度不妥或抗体本身达不到应有敏感度；（2）因为组织自溶，抗原扩散而造成抗原消失，尤其在长久固定标本中因抗原漏出而致假阴性，所以应多用新鲜固定之标本；（3）操作步骤不妥，如反应时间不够或过久、洗脱不够或温度过高；（4）组织或细胞中抗原含量很低，所用方法难以检测到，如用直接法检测为阴性，但改用间接法时则为阳性。

免疫组织化学技术介绍第36页2.假阳性结果主要原因是：（1）所用抗体与其它无关抗原有交叉反应，特异性差，尤其在应用多克隆抗血清时更易出现；（2）所用抗体浓度过高或染色过程中切片干燥造成抗体与组织产生非特异性结合；（3）组织或细胞中有内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶及生物素等产生非特异性显色；免疫组织化学技术介绍第37页免疫组化操作经验和体会操作中应注意以下问题：1.石蜡切片和冰冻切片均可，但要注意预防脱片。2.消除内源性过氧化酶和非特意性背景染色要充分。3.PBS洗涤要充分。4.要设阴性和阳性对照。5.显色注意底物要适量、时间要严格控制。免疫组织化学技术介绍第38页6.消除内源性生物素活性：预先以0.01%抗生物素溶液作用切片20min。7.ABC复合物应在临用前30min配置。8.ABC试剂保留温度以4℃为佳，保留达多年仍可获满意效果。9.抗体保留：-20℃分装冻存，或于4℃常规使用，切忌重复冻融。免疫组织化学技术介绍第39页（一）均匀背景染色1.酶-底物反应时间过长。2.在孵育中切片干燥。3.一抗或二抗稀释度不够。4.切片洗涤不充分。5.封闭所用正常血清不对。免疫组化常遇问题免疫组织化学技术介绍第40页（二）部分区域背景着色1.切片部分区域干燥。2.显色反应物在封片介质中是可溶，造成弥散。（三）部分区域不着色1.脱蜡不完全。2.切片部分区域干燥。免疫组织化学技术介绍第41页（四）各种孵育结果全部抗体均不着色1.H2O2终浓度不够或存放过久失效。2.稀释液中有错误正常血清（如猪抗兔酶标抗体稀释液中有正常兔血清）。3.显色反应物溶于脱水酒精、二甲苯或封片液中。免疫组织化学技术介绍第42页（五）一些抗体不着色1.需要消化而没有消化。2.封闭内源酶时使抗体活性下降。3.切片在裱片或干燥时过热。4.抗体过分稀释，一抗浓度小于二抗。5.抗体过期或频繁冻融.免疫组织化学技术介绍第43页（六）内源性酶活性：H2O2-甲醇封闭不恰当。（七）脱片1.切片无粘附试剂。2.切片不洁净。3.冰冻切片