脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座

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特有分子标志，含有分化潜力大、增殖能力

强、免疫原性低等特征。目标：观察脐带间充质干细胞对类风湿性关节炎免

疫炎性病理过程干预作用。方法：试验分为3组，建立Ⅱ型胶原诱导类风湿

性关节炎模型大鼠，脐带间充质干细胞组于

造模后第4周经大鼠尾静脉注射脐带间充质干

细胞，模型组注射生理盐水。

脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第4页引言

类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)时白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子a(tumornecrosisfactor-a，TNF-a)等炎症因子相互作用形成了一个细胞因子网络。其主要功效是促进B细胞增殖与分化，促进类风湿因子合成，促进肝细胞合成急性期蛋白，从而增强炎症过程，加重关节病变。它们亦可直接损伤内皮细胞，激活血小板，影响纤溶系统等，同时诱导内皮细胞、白细胞等合成释放各种炎症递质、黏附分子扩大炎症反应，加重免疫炎性血管和关节损伤，促进血液呈高凝性改变。脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第5页脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，Uc-MSC)表示各种胚胎干细胞特有分子标志，含有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、不受道德伦理限制等特征受到临床关注。课题以CIA大鼠为观察对象，探讨RA炎症黏附因子水平改变及Uc-MSC对其干预作用。脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第6页材料和方法设计：随机对照动物试验。时间及地点：试验于-09/-06在扬州大学医学院完成。材料：雌性近交系SD大鼠30只，清洁级，4~6周龄，体质量为(162±20)g，购于南京医科大学试验动物中心。脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第7页主要试剂

试剂及仪器

起源鸡Ⅱ型胶原

Sigma企业冰乙酸(分析纯)

中国恒利试剂厂L-DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶

美国Gibco企业大鼠白细胞介素1、大鼠白细胞

美国RD企业介素6、大鼠白细胞介素18ELISA试剂盒、大鼠TNF-aELISA试剂盒、大鼠血管细胞黏附分子1(vascularcelladhesionmolecule-1，VCAM-1)ELISA试剂盒、FITCMouseAnti-RatCD11b、FITCMouselgA脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第8页试验方法Uc-MSC制备：将人脐带剪成组织块后贴壁培养72h，去除未消化组织块，将原代脐带间充质干细胞用胰蛋白酶消化后加入含有体积分数10%胎牛血清L-DMEM培养基终止消化，重复吹打，移入离心管中离心10min后，去掉上清液，加入培养基后吹打，移入培养瓶中，37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，至第3代消化、离心后用生理盐水将Uc-MSC细胞浓度调至2×109L-1，4℃保留备用。

脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第9页

CIA大鼠模型建立：雌性近交系SD大鼠，随机分为正常组(见图1a)、模型组(见图1b)、Uc-MSC组，每组10只。制备0.01mol/L乙酸溶液中溶解鸡源性Ⅱ型胶原(质量浓度为5g/L)，充分溶解后与完全弗氏佐剂(CFA)等体积混合，并充分乳化成Ⅱ型胶原乳剂。予20只大鼠右后足跖皮内注以0.1mL免疫大鼠，第21天时再次以每只0.1mL剂量同部位皮内多点激发注射免疫大鼠，建立Ⅱ型胶原诱导类风湿性关节炎大鼠模型。

各组大鼠处理：取Uc-MSC2×109L-1，于造模后第4周Uc-MSC组经大鼠尾静脉注射，模型组注射生理盐水0.5mL。

脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第10页脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第11页Uc-MSC表型判定：采取流式细胞术对CD14、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105及HLA-DR表面标识进行表型分析，其中CD44、CD73、CD90和CD105阳性，阳性率>95%；CD14、CD34、CD45和HLA-DR阴性，阳性率<2%，确认为Uc-MSC细胞。指标检测：模型组和Uc-MSC组分别于第7天及第35天每组各取5只大鼠麻醉，于腹主静脉取血5mL，分别置肝素抗凝管和血清管中，检测中性粒细胞表面CD11b(FCM法)和血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、TNF-a、VCAM-1水平(ELISA法)。流式细胞术检测各组大鼠中性粒细胞表面CD11bMFI表示。脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第12页

主要观察指标：①各组大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、TNF-a、VCAM-1

水平。②各组大鼠中性粒细胞CD11b表示水平。③各组大鼠中性粒细胞表面CD11bMFI表示。统计学分析：采取SPSS10.0及Excel

统计学软件完成。组间比较采取方差分析，P<0.05为差异有显著性意义。脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第13页结果试验动物数量分析试验选取大鼠30只，分为3

组，无脱

失，全部进入结果分析。各组大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、TNF-a、VCAM-1水平：

模型组CIA大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、TNF-a、VCAM-1水平显著增高于正常组

(P<0.05)；Uc-MSC组经治疗后血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、TNF-a、VCAM-1水平较模型组差异有显著性意义(P<0.05)，治疗前后比较差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。

脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第14页各组大鼠中性粒细胞表面CD11b表示水平模型组CIA大鼠中性粒细胞表面CD11b表示水平显著增高(P<0.05)；Uc-MSC治疗后第35天中性粒细胞表面CD11b表示水平有显著改变(P<0.05)，流式细胞术检测中性粒、细胞表面CD11b，见图2，3。脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第15页脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第16页脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第17页

讨论

试验发觉CIA大鼠模型组上述炎症因子等水平显著高于正常组，认为CIA大鼠发病过程中存在炎症网络因子释放增加，是参加RA免疫性关节炎病理过程形成主要原因，促进RA临床症状发生和加重，所以，炎症因子指标对RA患者病情判断、治疗效果和预后有意义。迄今研究认为，脐带起源间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞理想替换物，而且含有更大应用潜能。由于P3代间充质干细胞活性最强，故本试验选取P3代间充质干细胞，干预CIA大鼠病理情况下高水平炎症网络因子表达。脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第18页间充质干细胞含有很强趋向炎症和损伤部位特征，在动物试验被证实。间充质干细胞这种在体内微环境作用下主动迁移(即损伤趋化作用)到受损伤部位进行修复称为间充质干细胞“归巢”作用。在体外间充质干细胞介导免疫调整作用研究中发觉，间充质干细胞经过T细胞、B细胞、DC细胞、以及NK细胞等多个步骤完成机体免疫调整作用，调整细胞因子表示。而类风湿关节炎病理基础主要是由T细胞介导包括B细胞、细胞因子、细胞凋亡、蛋白酶等各种原因所致本身免疫性疾病，所以，应用间充质干细胞治疗而干预RA炎症病理基础成为可行。脐带间充质干细胞对CIA大鼠炎症因子的干预专家讲座第19页试验发觉经Uc-MSC治疗后CIA大鼠血清白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子a、VCAM-1水平较模型组有不一样程度降低，可见间充质干细胞能够经过其趋化作用抵达炎症部位，进而经过对T细胞及B细胞免疫调整作用进行调控，从而抑制炎症因子表示。且CIA大鼠中性粒细胞表面CD11b平均摄取率显著低于模型组，影响CIA大鼠中性粒细胞表面CD11b表示峰值，使其显著左移，提醒Uc-MSC能使炎症因子及中性粒细胞表面CD11b表示降低，抑制类风关病理性炎症因子释放及内皮细胞异常活化，使炎症因