T-ZHCA 032-2024 驻留类化妆品温和性评价 重建表皮模型组织活力法

ICS71.100.70CCSY42团体标准T/ZHCA032—2024驻留类化妆品温和性评价重建表皮模型组织活力法Evaluationformildnessofleave-oncosmeticproducts—Tissueviabilitymethodofreconstructedepidermalmodel2024-01-15发布2024-04-15实施浙江省健康产品化妆品行业协会ⅠT/ZHCA032—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江省食品药品检验研究院提出。本文件由浙江省健康产品化妆品行业协会(ZHCA)归口。本文件起草单位:浙江省食品药品检验研究院、广东博溪生物科技有限公司、珀莱雅化妆品股份有限公司、杭州捷诺飞生物科技有限公司、上海家化联合股份有限公司。1T/ZHCA032—2024驻留类化妆品温和性评价重建表皮模型组织活力法1范围本文件描述了采用重建表皮模型对驻留类化妆品温和性功效的评价方法。本文件适用于驻留类化妆品温和性功效的评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。驻留类化妆品leave-oncosmeticproduct除淋洗类化妆品外的化妆品。3.2温和性mildness经过安全评估的受试物在正常、合理及可预见的使用条件下,未引起皮肤异常反应的特性。3.3重建表皮模型reconstructedepidermalmodel分离人包皮表皮细胞作为种子细胞,经过体外培养,制备成与人表皮组织具有相似结构及功能的三维组织模型。4试验原理将经安全性评价为无刺激性的受试样品均匀涂抹在重建表皮模型上,经过比刺激性测试更长的暴露时间或更高暴露量后,根据模型细胞的存活率,评价受试样品的温和性。5试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的三级水。5.1聚乙二醇单-4-辛基苯基醚(TritonX-100)。5.2十二烷基硫酸钠(SDS)。5.3异丙醇。2T/ZHCA032—20245.4噻唑蓝(MTT)。5.5磷酸盐缓冲液(DPBS):pH7.0~7.3,不含钙、镁离子。5.61.0%TritonX-100溶液:吸取TritonX-100(5.1)10μL,溶于990μL水中,配制成体积分数为1.0%的TritonX-100溶液。5.70.1%SDS溶液:称取SDS(5.2)10mg,溶于10mL水中,配制成质量分数为0.1%的SDS溶液。5.8MTT溶液:称取噻唑蓝(5.4)20mg,溶于20.0mLDPBS(5.5)中,配制成质量浓度为1mg/mL的MTT溶液,临用现配。5.9重建表皮模型试剂盒:EpiKutisRHE模型及其培养液或其他经验证的等效模型及其培养液。接收时模型与培养基接触界面不应有明显气泡或固体培养基变色情况(如黑紫色)。5.10死亡组织模型:将重建表皮模型置于-20℃环境下冷冻24h以上。6仪器设备6.1天平:分度值为0.0001g。6.2二氧化碳培养箱:37℃±1℃、CO2体积分数范围为(5±1)%、相对湿度≥95%。6.3超净工作台或生物安全柜。6.4外置活塞式移液器:最大量程为50μL、100μL、200μL。6.5连续分液器:最大量程为25mL。6.6计时器。6.7微孔板振荡器。6.8酶标仪:配570nm波长滤光片。7测试方法7.1MTT干扰因素排查7.1.1当受试样品与MTT有反应时:取MTT溶液1.0mL,加入受试样品液体80μL,分别在0h、1h、2h和3h时观察样品周边溶液颜色变化情况。当溶液颜色变成蓝紫色,应增加死亡组织模型组。7.1.2当受试样品有颜色时:取受试样品80μL,加入2mL异丙醇中,受试样品不溶于异丙醇,无须增加死亡组织模型对照组;受试样品溶于异丙醇,在570nm波长处测定吸光度(OD570),若OD570≥0.15,应增加死亡组织模型组。7.2测试步骤7.2.1重建表皮模型复苏在超净工作台或生物安全柜中将合格的模型转移至含0.9mL培养液的无菌6孔培养板,放入二氧化碳培养箱培养1h。更换全部培养液,放入二氧化碳培养箱培养过夜。模型底部与培养液间不应出现气泡。7.2.2试验分组和加样试验分为阴性对照组(水)、阳性对照组(1.0%TritonX-100溶液或0.1%SDS溶液)和受试样品组,当出现7.1中的情况时,增加死亡组织模型阴性对照组和死亡组织模型受试样品组,每组平行使用3个模型。加样前更换全部培养液,采用外置活塞式移液器吸取受试样品80μL均匀涂抹在模型表面,放入二氧化碳培养箱暴露24h。3T/ZHCA032—20247.2.3冲洗暴露结束后,采用连续分液器吸取25mLDPBS将模型逐个进行冲洗,每次2mL,未冲洗干净应增加冲洗次数直至冲洗干净,吸干残余的DPBS。7.2.4甲瓒提取将模型转移至含300μLMTT溶液的24孔培养板中,模型底部与MTT溶液间不应出现气泡。放入二氧化碳培养箱中培养3h后,转移至新的24孔培养板中,每孔加入2mL异丙醇,用封口膜密封培养板间隙。室温条件下将培养板固定在微孔板振荡器上振摇2h提取甲瓒,或在4℃条件下提取过夜。7.2.5OD570的测定提取结束后,用移液器吸头戳破模型,将模型内外提取液混合均匀,并转移至96孔培养板中,每个组织模型取2个复孔,200μL/孔。用异丙醇作为溶剂对照,取6个复孔,在570nm波长处读取吸光度(OD570),计算组织的存活率。7.2.6数据处理与统计分析无死亡组织模型对照组的存活率按式(1)计算。存活率×100%…………式中:A—受试样品的OD570;B—溶剂对照(异丙醇)的OD570平均值;C—阴性对照的OD570。有死亡组织模型对照组的存活率按式(2)计算。存活率×100%…………式中:A—受试样品的OD570;B—溶剂对照(异丙醇)的OD570平均值;C—阴性对照的OD570;D—受试样品死亡组织的OD570;E—阴性对照死亡组织的OD570。8结果判定8.1试验成立条件8.1.1阴性对照组的OD570范围为1.0~2.5。8.1.2阳性对照组的存活率<15%。8.1.3同一样品复孔间SD<18%。8.2结果评价8.2.1温和性:存活率≥50%。8.2.2不判定:存活率<50%,需结合其他试验进一步确认。4T/ZHCA032—20249试验报告试验报告至少应给出以下几个方面的内容:a)检验依据;b)样品和阳性对照组的信息,包括与试验操作相关的理化性状;c)重建表皮模型来源、质检报告等相关信息;d)试验条件和方法,包括试验具体步骤;e)数据处理与结果评价方法;f)试验的日期;g)结论;h)检验者、校核者和技术负责人签字,以及检验单位公章或检验专用章。5T/ZHCA032