蛋白质电泳技术

蛋白质电泳技术第1页/共36页影响电泳的环境因素电泳速度v=μepE=εζE/(Cη)C:6πor4πEpH:pI(~4-7),缓冲溶液pH(~8-9.5),向？极泳动离子强度I:0.02-0.2电渗温度：焦耳热介质：孔径、制胶重复性等第2页/共36页2.分类按原理:区带电泳,(移界电泳),稳态电泳,显微电泳第3页/共36页3.电泳仪及附属设备提供稳定直流电源的装置电压、电流、电功率稳定脉冲式电压 常压电泳仪(600V):净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳高压电泳仪(3kV):载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序超高压电泳(30-50kV):毛细管电泳第4页/共36页电泳槽板状电泳槽水平板垂直板管状电泳槽*自由界面电泳槽DYCP-33A型琼脂糖水平电泳仪(槽)(中号)DYCZ-22B型

单垂直电泳仪(槽)（大号）

第5页/共36页4.电泳的支持介质特性（要求）物理化学性质稳定化学惰性 均匀

种类分离原理特性物质薄膜类电荷密度化学惰性对流扩散小纸、醋酸纤维素薄膜、聚酰胺薄膜凝胶类电荷密度分子大小同上+多孔性分子筛效应（淀粉）、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、新型凝胶介质第6页/共36页5.检测-染色方法考马斯亮蓝：常用荧光染料：灵敏硝酸银：灵敏酶活性免疫学：专一特殊蛋白质糖蛋白、脂蛋白、铁蛋白、铜蛋白第7页/共36页三苯基甲烷衍生物，-SO3--蛋白质的碱性基团——染料-蛋白质复合物。R型G型二甲花青亮蓝-甲基取代的三苯基甲烷衍生物染色固定蛋白质-染色-脱色同时固定和染色-脱色脱色30%甲醇的10%乙酸溶液等第8页/共36页二、琼脂糖凝胶电泳

agarosegelelectrophoresis支持介质：琼脂糖结构：1,3连接的β-D半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成交联结构特点：大孔胶，适于核酸、线性DNA,RNA分离分析分离原理：0.2-50kb操作形式：水平电泳、免疫电泳、平板等电聚焦AgaroseD-galactose3,6-anhydroL-galactose第9页/共36页性能指标电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、脱水收缩作用纯度：硫酸根含量少，纯度高应用：核酸研究,不同浓度凝胶分离200bp-50kbDNA检测：荧光染料溴乙啶，电泳后染色操作过程：见AgaroseGelElectrophoresis.ppt第10页/共36页三、醋酸纤维素薄膜celluloseacetatefilm纤维素-乙酰化特点定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色较快速：电渗小灵敏度高，样品用量少：5微克蛋白质薄膜可保存操作简单快速价廉应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、脱氢酶、多肽等第11页/共36页四、聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE以polyacrylamidegel为分离介质分离原理：电荷密度+分子筛特点应用领域操作形式(圆盘电泳)垂直板电泳水平板电泳第12页/共36页1.聚丙烯酰胺凝胶polyacrylamidegel,PAG聚合化学聚合光聚合总浓度与交联度单体 交联剂 催化剂丙烯酰胺+ N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 ————PAGAcr Bis 加速剂过硫铵(AP)-化学聚合

or核黄素VB12–光聚合N,N,N’,N’-四甲基乙二胺TEMED反应影响因素产物特点应用浓度、比例、pH、温度、含氧、杂质等孔径较小分离胶光照条件孔径较大浓缩胶第13页/共36页第14页/共36页第15页/共36页第16页/共36页总浓度与交联度的影响凝胶浓度

T=[(a+b)/m]100%

(g/mL)交联度 C=[b/(a+b)]100%a=mAcr;b=mBis;m=Va/b：凝胶性状、孔径、分子筛效应等C=6.5-0.3T浓度筛选：标准凝胶T=7.5%或梯度胶第17页/共36页凝胶孔径CTnm1515256.62.41.92.88.02.31.62.43.610.01.91.42.03.012.01.7915.01.47蛋白质相对分子量适用凝胶浓度蛋白质相对分子量适用凝胶浓度<1万20-3010-50万5-101-4万15-20>50万2-54-10万10-15第18页/共36页2.连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(1959)凝胶孔径、缓冲液（样品、凝胶、电极）不变分离原理：样品电荷特点：制胶简单、条件简单恒定、分辨率不高适用：简单样品第19页/共36页3.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳含义：不同胶孔径、不同缓冲液分离原理：电荷效应+分子筛效应特点：样品成分浓缩-分离，分辨率高；操作复杂适用：广泛应用的主要电泳技术3种物理效应样品浓缩；分子筛效应；电荷效应第20页/共36页不连续性凝胶浓度：浓缩胶-分离胶缓冲液离子成分缓冲液pH电位梯度第21页/共36页制胶分离胶

样品胶浓缩胶抽气浓缩胶储液:2(10%Arc+2.5%Bis)1.0mol/LTris-HCl缓冲液pH6.8:140%蔗糖:4TEMED:0.0054mg/100mLVB120.001水封静置蒸馏水:4.930%凝胶储液:2.5(29.1%Arc+0.9Bis%)1.5mol/LTris-HCl缓冲液,pH8.9:2.510%Ap:0.05TEMED:0.006水封静置抽气25mmol/LTris+192mmol/LGly缓冲液pH8.3-+第22页/共36页4.SDS十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离原理:分子筛-分子相对分子质量蛋白质-SDS复合物呈棒状且大量带电(-),消除样品蛋白质分子间电荷差异应用：蛋白质纯度检测和相对分子量测定操作形式：多用垂直管或垂直板，不连续系统，或梯度胶第23页/共36页SDS第24页/共36页操作特点样品:制胶：缓冲液：分离、浓缩胶缓冲液均含SDS等分子量的确定染色考马斯亮蓝-蛋白质吸附量-近似Beer定律其他染色计算标准蛋白质mR，作lgMr-mR标准曲线待测蛋白mR-Mr同时测定第25页/共36页5.梯度凝胶电泳分离胶浓度为线性或指数梯度分离原理：蛋白质分子大小T4-30%,Mr5万-200万，分辨较小Mr差异可不与SDS反应，与SDS互补常加入SDS制胶：梯度混合器第26页/共36页五、等电聚焦电泳isoelectricfocusingIEF分离原理：利用pH梯度的介质分离pI不同的蛋白质分辨率pI相差0.01-0.001适用研究蛋白质微观不均一性测定蛋白质等电点操作形式:水平平板、(管式)第27页/共36页获得pH梯度人工pH梯度:不稳定，可用于制备自然pH梯度载体两性电解质：一系列pI不同的多氨基多羧基混合物(合成过程产生连续变化的氨基羧基比)不同pH范围NH2-R-COO-——NH2-R-COOH——NH3+-R-COOH-高pH电极液+低pH电极液高pI不同pI混合物低pI高pH两性缓冲低pH第28页/共36页等电聚焦支持介质聚丙烯酰胺应用较多避免分子筛作用薄膜-散热与经济加样方式放大作用检测固定脱色：除去两性电解质染色第29页/共36页六、双向电泳2DE第一次电泳后，在垂直方向再进行一次电泳单向电泳100种蛋白质双向电泳5000-8000种蛋白质(圆点)组合方式：第一向等电聚焦(pI)，第二向SDS-聚丙烯酰胺均匀/梯度胶电泳(Mr分离)为多第30页/共36页第31页/共36页I.E.F.and2DGE/article_info.php/articles_id/65/ch2d/第32页/共36页七、蛋白质印记将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品分离：高分辨电泳技术检测：灵敏、专一的免疫探测技术探针：用化学方法将有识别能力的物质(抗原、核酸等)和酶或同位素、荧光物质结