蛋白质工程蛋白质设计

蛋白质工程蛋白质设计第1页/共84页蛋白质与酶工程

第2页/共84页第二章蛋白质分子设计第一节:蛋白质分子设计原理第二节:基于蛋白质天然结构的分子设计第三节:全新蛋白质分子设计

第3页/共84页蛋白质分子设计蛋白质分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，属于交叉学科。设计过程主要依赖于蛋白质结构的测定和分子模型的建立，按照蛋白质结构功能的关系，综合运用各学科的技术手段，确保获得比天然蛋白质性能更加优越的新型蛋白质。是蛋白质工程的一个重要方面。第4页/共84页蛋白质分子设计基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的核糖核苷酸序列（RNA）→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列（DNA）第5页/共84页第一节蛋白质分子设计原理

一、蛋白质分子设计的分类蛋白质设计的目的：1、为蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息。如提高蛋白质的热，酸稳定性等2、探索蛋白质的折叠机理。如简单蛋白质建筑或骨架的从头设计是研究蛋白质相互作用的类型及本质的很好途径，为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。第6页/共84页一、蛋白质分子设计的分类

（一）蛋白质分子设计的层次可分为两个层次在蛋白质三维结构已知基础上所进行的直接将立体结构信息与蛋白质的功能相关联的高层次的设计工作在未知立体结构的情形下借助于一级结构的序列信息及生物化学性质所进行的分子设计工作第7页/共84页一、蛋白质分子设计的分类（二）蛋白质分子设计分类按照改造部位的多寡分为三类：第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；在已知结构的天然蛋白质分子多肽链内的确定位置上，进行一个或少数几个氨基酸残基的改变，以研究和改善蛋白质的性质和功能。主要是置换，删除或插入氨基酸，依赖基因水平。第8页/共84页（二）蛋白质分子设计分类第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装；以期望能转移相应的功能，获得具有新特点的蛋白质分子。又称分子剪裁。第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质，使之具有特定的空间结构和预期的功能。第9页/共84页二、蛋白质分子设计的基础蛋白质序列，蛋白质结构与功能及结构与功能关系之间的信息对于蛋白质工程及蛋白质设计都非常重要。蛋白质结构与功能是开展蛋白质分子设计的基础，对蛋白质结构与功能之间的认识对蛋白质分子设计是至关重要的决定着蛋白质分子设计的成功与否。具体包括：1、蛋白质生物功能的多样性2、蛋白质功能由其高级结构决定3、蛋白质的一级结构与其构象及功能的关系4、蛋白质空间构象与功能活性的关系5、结构生物学与生物信息学促进蛋白质分子设计第10页/共84页总结1.一种基因可编码产生多种蛋白质，一种蛋白质可以产生多种活性多肽，一种活性多肽可以产生多种功能2.蛋白质的功能与高级结构相联系，生物学活性和理化性质主要决定于空间结构的完整性。3.一级结构决定了它的二级，三级结构，如果一级不破坏，就能恢复到原来的三级结构一级相似的蛋白质，其基本构象及功能也相似第11页/共84页4.别构效应：在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化。第12页/共84页二、蛋白质分子设计的基础以肌红蛋白和血红蛋白为例阐述蛋白质空间结构与功能的关系1.肌红蛋白由一条153个氨基酸组成的肽链和一个血红素辅基组成。分子量为17800肌红蛋白的三级结构是由一簇八个a-螺旋组成的，螺旋之间通过一些片段连接。第13页/共84页抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin）的三级结构第14页/共84页02与肌红蛋白的结合卟啉铁和F8（93）His（近侧）的咪唑N结合。底6的配位键和O2结合。O2和四吡咯环呈60度倾斜。高铁肌红蛋白中水代替O2填充该部位。氧结合是一个空间位阻区域E7His（远侧）的咪唑环与Fe原子的距离远，不发生作用，但与分子O2能紧密接触，被结合的O2在His（近侧）的咪唑N和Fe原子之间。第15页/共84页血红蛋白的结构血红蛋白有两种链，4个亚基组成人在不同发育阶段血红蛋白亚基的种类是不相同。第16页/共84页血红蛋白的三维结构

图血红蛋白中亚基的排列

A正面观B侧面观第17页/共84页图血红蛋白α链和β链和肌红蛋白构象的相似性第18页/共84页氧合血红蛋白显著改变Hb的四级结构图血红蛋白半分子（αβ二聚体的侧面观）装配接触

α1β1和相同的α2β2接触。涉及螺旋B、G、H和非螺旋段GH拐弯的30多个残基，接触面大，对亚基的装配很重要。当血红蛋白从去氧变为氧合形式时它们不变。滑动接触

α1β2和相同的α2β1接触。涉及螺旋C、G、H和非螺旋段FG拐弯的19个残基，当血红蛋白因氧合作用而发生构象变化时，这些接触也发生改变。第19页/共84页作为动态构象分子，血红蛋白可以看作是αβ-二聚体的二聚体，也可以看作是相同的二聚体半分子组成：α1β1-亚基和α2β2-亚基对。每个αβ-二聚体作为钢体移动。当血红素基氧合时，分子的两个二聚体半分子彼此滑动。如果一个αβ-二聚体固定不动，则另一个αβ-二聚体将绕一个设想的αβ-二聚体的偏心枢轴旋转约15°并平移0.08nm。

去氧血红蛋白

氧合血红蛋白第20页/共84页氧合血红蛋白和去氧血红蛋白代表不同的构象态（1）T态（紧张态）和氧的亲和力低，是氧合血红蛋白的形式。（2）R态（松弛态）和氧的亲和力高，是去氧血红蛋白的形式。氧与一个处于T态的亚基结合后，转变为R态。原因是稳定T态的作用力被破坏。第21页/共84页二、蛋白质分子设计的基础总结：1.首先要通过各种方法来获得蛋白质的三维结构信息，2.在获得结构信息的基础上利用生物信息学及计算机模拟技术确定其特定功能相关的位点或结构域作为突变位点或要改变的序列区域，3.然后利用PCR等技术构建突变体并进行突变体的性质表征直到获得所需的蛋白质。第22页/共84页

计算机模拟

基因构建突变蛋白质产品功能分析蛋白质设计循环第23页/共84页三、蛋白质分子设计原则1、活性设计2、对专一性的设计3、Scaffold设计4、疏水基团与亲水基团需合理分布5、最优的氨基酸侧链几何排列第24页/共84页三、蛋白质分子设计原则1.活性设计：是蛋白质分子设计的第一步，主要是考虑被研究的蛋白质功能，涉及选择化学基团和化学基团的空间取向。在这类设计中应采用天然存在的氨基酸来提供所需的基团，尽管原则上并不限制引入其他外来基团。同时还应该考虑辅因子的使用。第25页/共84页三、蛋白质分子设计原则2.对专一性的设计功能性蛋白质在发挥其生理作用时，总是与其他分子发生专一性相互作用，理解并设计化学基团与底物的专一性结合对蛋白质设计也是十分重要的。第26页/共84页三、蛋白质分子设计原则3.框架设计：是指对蛋白质分子的立体设计。天然蛋白质是框架化的。也就是说，催化部位和底物结合部位要适当地安装在大分子载体之中，给予各个基团以适当的空间排布，才能具有催化活性功能。因此要设计的蛋白质活性分子，也必须框架化。但是对复杂的多肽链而言，需要预测三级结构，需要大量的计算筛选所需的一级结构，其结果很难预测。第27页/共84页三、蛋白质分子设计原则4.疏水基团与亲水基团需合理分布这种分布并不仅仅是简单地使暴露在外面的残基具有亲水性，埋藏在内部的残基具有疏水性而是还应安排少量的疏水残基在表面，少量亲水残基在内部。在蛋白质分子设计过程中要在原子水平上区分侧链的疏水部分与亲水部分。第28页/共84页三、蛋白质分子设计原则5.最优的氨基酸侧链几何排列为了获得蛋白质结构及功能的专一性，我们在构建一个蛋白质模型时必须满足所有合适的几何要求，并且要满足蛋白质折叠的几何限制第29页/共84页四、蛋白质分子设计的程序1、收集相关蛋白质的结构信息2、建立所研究蛋白质的结构模型3、结构模型的生物信息分析4、选择设计目标5、序列设计6、预测结果7、获得蛋白质8、新蛋白质的检验9、完成新蛋白质设计第30页/共84页四、蛋白质分子设计的程序1.收集相关蛋白质的结构信息收集待研究蛋白质的一级结构，立体结构，功能结构域及与之相关的同源蛋白质等相关数据，为蛋白质分子设计提供依据和蓝本。但在进行蛋白质分子设计时，首先要查找PDB了解三维结构，同时应查找同源性较高的蛋白质的三维结构。第31页/共84页四、蛋白质分子设计的程序2.建立所研究蛋白质的结构模型文献中有待研究的蛋白质的三维结构，则直接采用，还可通过蛋白质X射线晶体学等方法测定蛋白质的三维结构，此外还可以依据已有的同源性较高蛋白质的三维结构，结合三维结构预测方法，对待研究蛋白质进行结构预测。第32页/共84页四、蛋白质分子设计的程序3.结构模型的生物信息分析分析确定其有三维结构的特点，功能活性区域以及分布，结构中存在的二硫键数目和位置等，为选择设计目标提供依据。4.选择设计目标确定所要建造的三级结构，找出对所要求的性质有重要影响的位点或区域。目前的水平，所选择的目标均是一些残基不多，结构简单，并且具有对称性的多肽结构。第33页/共84页四螺旋束第34页/共84页NCβ链以反平行的上-下方式顺序连接，最后一股连与第一股链以氢键结合，形成一个类似桶状的结构第35页/共84页四、蛋白质分子设计的程序5.序列设计选择的序列应尽可能地不同于天然结构的序列，设计时，要充分考虑氨基酸残基形成特定二级结构的倾向性。6.预测结果需通过理论预测方法预测出所设计的多肽的二级结构和三级结构，初步检验设计的正确程度，检验目标模型与预期目标的吻合程度并在此基础上加以调整和更正，使目标模型达到预期。第36页/共84页四、蛋白质分子设计的程序7.获得新蛋白质多肽化学合成方法，特别是固相合成技术，为合成新设计的蛋白质分子提供了有效途径，同时也可通过基因工程手段，人为合成或改造基因，实现蛋白质的改造，然后进行基因表达，并分离纯化获得新蛋白质分子，为进行新蛋白质功能的检验提供材料。第37页/共84页四、蛋白质分子设计的程序8.新蛋白质的检验三个方面检测，1是否存在蛋白质多聚体状态2.二级结构与预期的是否吻合，3.是否具有三级结构。对蛋白质分子进行功能设计，还需检验新蛋白质的功能活性，看新蛋白质的功能活性是否达到设计目标。9.完成新蛋白质设计验证，评价，依据设计出的结果，进行多轮反复设计，反复修改和反复试验，直至达到目标。第38页/共84页例：蛋白质突变体设计步骤1）以蛋白质的三维结构为基础，利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸2）利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构3）预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质结构-功能或功能-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质第39页/共84页注意问题A应确定蛋白质折叠敏感的区域，包括带有特殊扭角的氨基酸、盐桥、密堆积区等B应确定对功能非常重要的位置C考察剩余位置对所希望改变的影响D当进行互换或插入/删除残基是应考虑他们对结构特征的影响，如疏水堆积、侧链取向、氢键、盐桥等第40页/共84页蛋白质设计原则掌握①内核假设。所谓内核是指蛋白质在进化中保守的内部区域。在大多数情况，内核由氢键连接的二级结构单元组成。②所有蛋白质内部都是密堆积(很少有空穴大到可以结合一个水分子或惰性气体)，并且没有重叠。③所有内部的氢键都是最大满足的(主链及侧链)。第41页/共84页④疏水及亲水基团需要合理地分布在溶剂可及表面及不可及表面。⑤在金属蛋白中，配位残基的替换要满足金属配位几何。⑥对于金属蛋白，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。⑦最优的氨基酸侧链几何排列。⑧结构及功能的专一性。形成独特的结构，独特的分子间相互作用是生物相互作用及反应的标志。第42页/共84页蛋白质分子设计流程图天然蛋白质蛋白质晶体学新蛋白质蛋白质三维结构结构与功能关系分析选择设计目标蛋白质序列设计结构分析与原先的结构比较蛋白质合成定位突变分离、纯化及表征蛋白质结构预测从数据库输入第43页/共84页蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面在蛋白质设计开始之前，要对所要求的活性进行筛选。由于真菌与细菌相对容易处理，因此它们是一个生物活性物质源。由于基因工程的发展，真核基因表达技术的发展使动物蛋白质与植物蛋白质的数目迅速增长，又增加了新的生物活性物质源。第44页/共84页蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面

筛选以及纯化蛋白质需要进行细致的表征，测定它们的序列、三维结构、稳定性、催化活性等。专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易。

第45页/共84页蛋白质分子设计大致涉及的几个重要方面计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置。建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能对蛋白质工程是至关重要的。在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域后，可以进行定位突变，但要得到具有预期结构与功能的蛋白质是不容易的，可能需要经过几轮的循环。第46页/共84页蛋白质三维结构知识的必要性

蛋白质三维结构知识对于蛋白质工程是绝对必要的。目前PDB(ProteinDataBank)已收集数以万计个蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍。当我们开始对某一天然蛋白质进行蛋白质分子设计时，首先要查找PDB了解这个蛋白质的三维结构是否已被收录。如果PDB中没有收录又未见文献报道，我们需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型。第47页/共84页第二节基于天然蛋白质结构的分子设计

一、概述

蛋白质结构与功能的关系的认识对蛋白质设计是至关重要的，蛋白质的结构涉及一级结构(序列)及三维结构。即使蛋白质的三维结构是已知的，选择一个合适的突变体仍是困难的，这说明蛋白质设计任务的艰巨性，它涉及多种学科的配合，如计算机模拟专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家等的合作与配合。第48页/共84页

蛋白质结构与功能的关系对于蛋白质工程及蛋白质分子设计都是至关重要的。如果我们想改变蛋白质的性质，必须改变蛋白质的序列。现有的蛋白质分子设计大多数主要是依据蛋白质的一级结构。第49页/共84页一、定位突变基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰，替换或删除等，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。基因定位突变是指从基因水平上进行蛋白质分子的改造，即采用定位诱变的方法，对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入，删除，置换和改组，然后对突变后的基因进行蛋白表达并分析所表达蛋白质的功能活性，为蛋白质分子改造提供新的设计方案。第50页/共84页一、定位突变

（一）定位突变的设计目标及解决办法常见的设计目标是提高蛋白质的热，酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构功能关系的研究。改善蛋白质的稳定性成为蛋白质设计和改造的重要目标之一。Hartley等于1986年完成了一个我们所要的有关蛋白质重要性质设计目标及解决办法表，该表至今仍有参考价值。第51页/共84页设计目标解决办法热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高酶学性质引入二硫桥增加内氢键数目改善内疏水堆积增加表面盐桥把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu把Trp转换为Phe或Tyr把Cys转换为Ala或Ser把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基替换表面荷电基团His、Cys以及Tyr的置换内离子对的置换专一性的改变增加逆转数(turnovernumber)改变酸碱度蛋白质设计的目标及解决办法第52页/共84页（二）定位突变种类基因突变的方式分成三类1、插入一个或多个氨基酸残基；2、删除一个或多个氨基酸残基；3、替换或取代一个或多个氨基酸残基。最大量的定位突变是在体外利用重组DNA技术或PCR方法来实现的。定点突变，盒式突变第53页/共84页（二）定位突变种类1.定点突变：蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码子决定的，只要改变其中的一个或两个碱基就可以改变氨基酸的种类，从而产生新的蛋白质。通常是改变功能区域某个位置的氨基酸，以研究蛋白质的结构，稳定性或催化特性。第54页/共84页（二）定位突变种类2.盒式突变一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析利用。拟改造处－－添加－－消化－－合成－－替代

这样一次处理可以得到多种突变型基因第55页/共84页限制性内切酶目标基因中要有适当的限制性内切酶位点：利用遗传密码简并性确保盒式突变序列的正确插入方向第56页/共84页（三）定位突变的程序1、建立所研究蛋白质的结构模型（X射线晶体学等）2、找出对所要求的性质有重要影响的位置（筛选）3、预测突变体的结构（相关软件）4、构建突变体，获得突变体蛋白（PCR）5、突变体蛋白质的检验（测定序列）第57页/共84页结构与功能的容忍度

蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度。Fersht等替换了酶的所有内核残基。结果表明23％的突变体保留了酶的活性。Mathews及其合作者在溶菌酶内核中替换多至10个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠。这些结果说明不同的氨基序列具有相近的设计的结构。第58页/共84页（四）定位突变残基的鉴定1．根据已知结构信息确定功能残基需要较大量的纯的突变蛋白，不能用于常规的大量的分析2．突变实验方法鉴定功能残基

随机突变和删除分析及连接片断扫描突变3．利用蛋白质同源性鉴定功能残基第59页/共84页（五）定位突变的应用

T4lysozyme(a)Isa164-aapolypeptidechainthatfoldsintotwodomains:TheN-terminaldomainisof+type,andtheC-terminaldomaincomprises7shorthelices.(b)Hasnodisulfidebonds(c)HastwoCysresidues,Cys54andCys97(thatarefarapartinthefoldedstructure)第60页/共84页（五）定位突变的应用T4lysozymeT4噬菌体溶菌酶1.包含164个氨基酸残基2.不存在二硫键3.只有两个半胱氨酸，半胱54和半胱97设计：1.引入3对二硫键，蛋白质稳定性增加突变成五个半胱氨酸2.去除甘氨酸或引入脯氨酸都能使突变体变性温度提高。3.进行N端残基突变，稳定螺旋偶极。第61页/共84页Stabilizingthedipolesofhelicesincreasesstability(contd.)第62页/共84页二.蛋白质分子拼接分子剪裁：替换蛋白质分子的一个肽段，或一个结构域将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。1）嵌合抗体2）人源化抗体第63页/共84页第64页/共84页第65页/共84页第66页/共84页第三节全新蛋白质设计特征：

全新蛋白质设计是另一类蛋白质工程。是指基于对蛋白质折叠规律的认识，从氨基酸的序列出发，设计制造自然界不存在的全新蛋白质使之具有特定的空间结构和预期的功能。第67页/共84页蛋白质的全新设计内容蛋白质结构的从头设计蛋白质功能的从头设计取得的进展：血红素结合蛋白、氧化还原活性蛋白质、DNA结合蛋白及基于蛋白质的高分子材料。第68页/共84页第三节全新蛋白质设计一、全新蛋白质设计方法（一）全新蛋白质设计程序PDA循环：设计-－模拟－实验－分析（二）设计目标的选择目标：一个确定的结构，或者它能按照预想折叠成所期望的结构选择：天然蛋白质结构中一些比较稳定的模块作为设计目标。如四螺旋束第69页/共84页第三节全新蛋白质设计一、全新蛋白质设计方法（三）设计方法1.设计方法种类：1）思路：首先选择某种主链骨架作为目标结构，随后固定骨架，寻找能够折叠成这种结构的氨基酸组合。2）方法：逆折叠法，穷举法，死端排除法，序列最简化方法，模板组装合成法，自动设计方法。第70页/共84页第三节全新蛋白质设计2.设计中需考虑的因素：正确选择二级结构倾向性的残基，正确布置适应目标结构的二元模式，，正确选择转角，帽结构以连接和终止螺旋，正确选择适应于堆积核心的疏水侧链等还要考虑到互补堆积。第71页/共84页第三节全新蛋白质设计3.设计中的困难局部细节，会出现呈一种熔球状态或者说是部分折叠。缺乏天然蛋白质的那种高度堆积特异的构象。第72页/共84页二、蛋白质结构的从头设计中心问题：设计一个具有稳定及独特的三维结构的序列克服的障碍：线性聚合链的构象熵采取的策略：

1）使相互作用的强度与数目达到最大（理论基础：分析已知结构的天然蛋白质中的二级结构单元）

2）通过共价交叉连接减小折叠的构象熵第73页/共84页二、蛋白质结构的从头设计

（一）蛋白质结构的从头设计原则1.二级结构的设计原则2.超二级结构和三级结构的设计原则第74页/共84页

１．二级结构的设计原则

优点：设计或合成都比较简单缺点：蛋白质的稳定性（熵较