药理学实验与设计

药理学实验与设计第1页/共54页药理学研究的目的是通过动物实验来认识药物的作用特点和规律，为评价药物可能产生的临床作用提供科学依据，为开发新药和/或指导临床用药提供依据。药理学实验的对象通常是特定生物体，存在个体差异，为保证实验结果的准确、可靠，必须对新开展的实验进行设计。遵循的原则：随机、对照、重复。2一、实验设计的基本原则第2页/共54页31、

随机原则随机是减少实验材料差异的最基本方法。由于动物间的个体差异不可避免，通过随机分组的的方法使各组间不受主观因素的影响。随机原则的应用：动物分组、时间的先后、操作人员、不同的仪器等。

第3页/共54页随机分组的方法：

编号抽签、投硬币法、随机数字表法、随机数字法。目前主张“均衡下的随机”即先将主要因素（体重，性别等）均衡归类分档，再将难控制的因素（活泼程度、饥饱程度、疲劳程度、性周期……）随机安排。4第4页/共54页5随机数字表第5页/共54页62、

对照原则对照是比较的前提，为消除无关因素对实验结果的影响，实验中必须设立对照组。对照应符合齐同可比原则，除试验药物和处理的差别外：实验动物要求种属、性别、年龄相同，体重相近；实验的季节、时间和实验室的温度、湿度也要一致；操作的手法前后要相同。第6页/共54页7根据实验研究的目的和要求不同，可选用不同的对照形式，常用的对照形式有（1）自身对照是指同一个体给药前后某种观测指标的变化，或者两种药物一前一后交叉比较。例如血压用药前、后的对比。自身对照比组间效率高，且个体的影响小，是比较有效的对照方法。第7页/共54页（2）组间对照实验中设立若干与研究组相平行的组，以便将实验结果与其相比较，这种与实验组相平行的组别为对照组。组间对照是药理学实验最常用的对照方法。组间对照可以是两两对照，也可以是多组对照。对照组根据处理的方法不同，可分为空白对照、实验对照、阳性对照。8第8页/共54页空白对照(正常对照)：是指设立不给药物处理的对照，用以观察不给药（或不加任何处理）时实验对象的反应和观察指标的变化。实验对照：对实验对象进行与实验组相同的处理，但是不给药物，设立此对照的的目的在于消除实验过程对实验结果的影响，如麻醉、注射、手术等处理过程。阳性对照：同样实验条件下设立给予同类药物已知标准品实验组。9第9页/共54页10

组间对照常见动物分组空白对照组实验对照组受试药小剂量组受试药中剂量组受试药大剂量组阳性药对照组第10页/共54页11驱白巴布期片功效：通脉，理血。用于白热斯（白癜风）。第11页/共54页12(3)其他

除自身对照和组间对照外，还有其他对照方法，如正常值对照，文献值对照等。第12页/共54页3.重复原则重复是保证实验结果可靠的重要措施之一。重复有两方面的含义：重现性：同样条件下可以得到相同的实验结果。重复数：实验要有足够的次数或例数。实验中要求的重复数一方面有利于消除个体差异和实验误差，一方面是对实验结果的重现性验证。第13页/共54页一般而言，计量资料的样本数每组不少于5例，以10~20例为好。计数资料的样本数则需每组不少于10例，以30例为好。

14动物实验每组所需的样本数动物计量资料计数资料小(小鼠、大鼠、蛙)≥10≥30中(兔、豚鼠)≥6≥20大(犬、猫)≥5≥10第14页/共54页15

二、实验设计的基本要素处理因素实验对象实验效应无论是新药的研制，还是药物的药效学研究或毒理学研究，其药理学实验设计都包括最基本的三大要素。第15页/共54页16

实验中根据研究目的确而定的，由实验者人为施加给受试对象的因素称处理因素，如给病用药物、给病人实行某种手术等。

处理因素第16页/共54页17(1)处理因素的强度强度亦称水平，对药物来说是指药物的剂量大小。

处理因素及其水平可以是一个或多个，它们的组合包括：单因素单水平单因素多水平多因素单水平多因素多水平在设置处理因素时应注意以下几个问题第17页/共54页18①单因素单水平设计

是指给予一种处理因素，观察一种药物处理前后的变化。

如一种药物，一个剂量对血压的作用。

单因素：普萘洛尔或硝苯地平单水平：一个剂量或一个指标单因素设计实验简单，效率低。第18页/共54页19②单因素多水平设计单因素：一种药物

多水平：多个剂量或多个指标

如一种药物，三个剂量对庆大霉素肾毒性的影响，指标包括尿蛋白、Cr、BUN、肾组织形态的影响。单因素多水平设计效率高，使用广泛。第19页/共54页20③多因素单水平设计

多因素：几种药物

单水平：一种模型

几种药物对四氯化碳肝毒性的影响包括GPT、GOT、肝组织形态的影响。多因素单水平设计效率高，但复杂，主要用药物筛选。第20页/共54页21

④多因素多水平设计

观察几种药物对几个指标的影响；或几种药物对几种模型的作用比较。

多因素：普萘洛尔、硝苯地平、卡托普利多水平：血压、心率、心收缩力的影响多因素多水平设计效率高，复杂。第21页/共54页22(2)明确非处理因素非处理因素虽然不是我们的研究因素，是干扰实验结果的因素，产生混杂效应，所以这些非处理因素又称混杂因素。

如年龄、休重、性别的影响。

若两组年龄、休重、性别构成不同，则可能影响结果比较。第22页/共54页23(3)处理因素的标准化

处理因素在整个实验过程中应做到标准化，即保持不变，否则会影响实验结果的评价。

如实验设计中处理因素是药物，则药物的剂型、给药途径、质量(成分、出厂批号等)必须保持不变。第23页/共54页24

实验对象实验对象的选择十分重要，对实验结果有着极为重要的影响。实验对象包括：整体动物：正常动物，麻醉动物，病理模型；

离体器官：子宫、心脏、小肠、血管条、气管条等；

组织及细胞：肝细胞、心肌细胞、系膜细胞、肿瘤细胞等。第24页/共54页25离体心脏实验第25页/共54页26

实验效应（指标）

指标分类及统计方法

计数指标（定性指标）如惊厥或不惊厥、死亡或存活等。用2方检验。

计量指标（定量指标）

如血压值、酶活性单位、时间等。用t-检验、配对检验等。第26页/共54页27指标的选定需符合以下原则(1)特异性能反映某一特定现象且不与其他现象相混。

肝功能的金指标：AST（谷草转氨酶），ALT

（谷丙转氨酶）。肾功能的金指标：BUN（血尿素氮）、Cr（血肌酐）

高血压病的特异指标：血压(尤其是舒张压)第27页/共54页28(2)客观性易于量化、经仪器测量而获得的指标，如心电图、血常规分析、生化检测等化验室的检查结果；

病理学的诊断意见；

菌学培养结果等。第28页/共54页29(3)灵敏性根据实验要可相应显示出微小的变化。如肝功能指标：ALT（谷丙转氨酶）98单位，100单位。

它是由实验方法和仪器的灵敏度共同决定的。如果灵敏性差，对已经发生的变化不能及时检测出来，或常常得到假阴性结果，这种指标应该放弃。第29页/共54页30(4)可行性

指标有文献依据

符合本实验室条件

符合研究者实际水平第30页/共54页31选择指标时，还应注意以下关系及特点

①计量指标优于计数指标②动态指标优于静态指标，把静态指标变为动态指标如体温、疗效、体内激素水平变化等，可按时、日、年龄等作动态观察。③所选指标要便于统计分析。第31页/共54页适当的用药剂量是保证实验成功的重要环节，也是常遇到的问题。确定用药剂量常采用的方法：

预实验确定用药剂量

根据经验和已有资料确定使用的剂量。32三、药物剂量设置第32页/共54页

预实验是正式实验前的重要步骤，根据预备试验所得结果或经验对原始实验设计进行必要的修正。预实验着重解决以下问题：

修正实验样本的种类和例数。检查实验观察指标是否客观、灵敏和可靠。改进实验方法和熟悉试验。确定最适剂量。发现值得进一步研究的线索。完善实验方案。

331，预实验第33页/共54页研究的药物是已知药物的类似物，可以已知药物为参考。根据体外有效浓度推测达到相应血药浓度的给药剂量。根据药物的作用原理确定给药剂量时主要考虑药物发挥作用所需要的浓度和临床应用的要求，如受体的激动剂或拮抗剂选用的大剂量应<10-5mol/L。一般认为EC50>10-6mol/L的受体拮抗剂开发价值不大。多个剂量时，一般动物实验的剂量间隔应在2～5倍。342，根据经验和资料确定用药剂量第34页/共54页35驱白巴布期片功效：通脉，理血。用于白热斯（白癜风）。第35页/共54页实验动物指由人工培育，来源清楚，遗传背景明确，对其携带的微生物和寄生虫实行监控，用于生命科学研究、药品与生物制品生产和检定，以及其他科学研究的动物。未经驯化的野生动物，有时也用于实验，但由于遗传背景不清楚，健康状况不稳定，因而对试验物反应缺乏一致性，实验结果可信度和重复性都很差。36四、实验动物的基本知识第36页/共54页1，按微生物学分类普通动物：仅要求不携带人畜共患病病原体和动物烈性传染病病原体，饲养环境开放。清洁动物（Cleananimal）：除不携带普通动物应排除的病原体外，还不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体，饲养空气需过滤，用品灭菌。无特定病原体动物（Specificpathogenfreeanimal,SPF）不存在特定病原微生物和寄生虫的动物。

（一）实验动物的分类方法37第37页/共54页无菌动物（Germfreeanimal,GF）：动物体内外不能存在可检出的生命体。由剖腹产取出动物，无菌母鼠代乳或人工哺乳，人工净化环境培育。悉生动物(Gnotobiotesanimal,GN)：已知菌动物。SPF和GF动物不仅人工监控其携带的微生物、寄生虫，而且是经剖腹产净化获得的。国际上是把实验动物的微生物和寄生虫控制分成普通动物，SPF动物和无菌动物（悉生动物）三个等级。38第38页/共54页39第39页/共54页40小鼠净化笼具第40页/共54页41第41页/共54页几种类别实验动物的比较无菌动物、SPF级动物、清洁级动物和普通级动物比较类别无菌动物SPF级动物清洁级动物普通级动物传染病无无无有或可能有寄生虫无无无有或可能有实验结果明确明确明确有疑问应用动物数少量少量较少多或大量统计价值很好很好较好不准确第42页/共54页2、按遗传学控制分类近交系：杂种动物经过相当于20代全同胞兄妹单纯连续繁殖获得的，染色体基因趋于纯合，品系内个体差异趋于零。突变系：正常染色体的基因发生了突变，具有某种特殊性状表型的各种遗传缺陷的品系。封闭群动物：引种于某亲本或同源亲本的动物，让其不以近交形式，也不与群外动物杂交而繁衍的动物群，目的是要求整个群体尽量防止近亲交配而保持着遗传变异，也就是说既保持群体的一般特性，又保持动物的杂合性43第43页/共54页举例：小鼠ACI系1．形成：1926年由哥仑比亚大学肿瘤研究所Curtis和Dunning培育。1945年Heston繁殖30代，1950年美国NIH繁殖41代，最后由Dunning（或NIH）育成。近交代数：F>100。2．主要特性：癌发生率:雄鼠自发性肿瘤：肾上腺为16%，脑垂体为5%，皮肤和耳道以及其他类型为6%。雌鼠自发性肿瘤：脑垂体为21%，子宫为13%，乳腺为11%，肾上腺和其他类型为6%。34～37月龄老年雄性小鼠，自发性前列腺癌17%。该品系小鼠可使M-C961、970、R3234肿瘤移植生长，吸收中等剂量的乙烯雌酚后乳腺肿瘤增加。3.寿命：需长时间驯养，对新环境的适应时间也长。雄鼠平均活存时间113周，雌鼠108周。44第44页/共54页45动物种属的选择在药理实验中，选用的动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗和猴等哺乳动物。其中小鼠和大鼠应用广泛，它们具有种系清楚，容易获得，易于管理，大量供应等优点。这些动物除可整体应用外，也可取其离体器官、组织或细胞进行不同实验水平的研究。（二）实验动物的选择第45页/共54页46⑴所选的动物必须健康，要求SPF级动物。⑵对呕吐敏感的动物：鸽子、猫、狗；小鼠、大鼠、豚鼠、家兔对呕吐反应不敏感。⑶抗高血压的药物：应选择家兔。

心肌缺血药：宜选用狗、猫、兔和大鼠。⑷抗凝血药：选择家兔和大鼠，雄性为好，避免动物发情周期性的影响。

所选动物要求：第46页/共54页47⑸呼吸系统药物

镇咳药：首选豚鼠，因为豚鼠对化学剌激和机械剌激都敏感，易引起咳嗽；

祛痰药：宜选用雄