疾病基因组学专家讲座

疾病基因组学研究进展

Genetics&GenomicsofHumanDiseases

夏昆医学遗传学研究进展疾病基因组学第1页疾病基因组学内含疾病基因组学策略和技术疾病基因组学研究进展与应用疾病基因组学第2页一、疾病基因组学内含

疾病基因组学第3页人类疾病分类染色体病：染色体数目或结构异常所致疾病称为染色体病。单基因病：因为单个基因突变而引发遗传病。因为单基因病发生基本上受一对等位基因控制，故又称孟德尔遗传病。多基因病：受多个微效基因和环境原因共同影响疾病，又称多因子病或复杂疾病。人类遗传性疾病线粒体遗传病：线粒体DNA突变能够引发人类疾病。取得性疾病（不会遗传）疾病基因组学第4页Duchenne肌营养不良症（假性肌肥大型）白化病患者单基因病染色体病唇裂与腭裂多基因病疾病基因组学第5页JohnForbesNash——著名数学家；1994年诺贝尔经济学奖得主；博弈论创始人之一凡高和他向日葵疾病基因组学第6页疾病基因组学第7页疾病基因组学第8页遗传学研究三大里程碑1953年发觉DNA双螺旋年完成HGP计划年开启国际人类单体型图计划

认识人类疾病遗传学基础成为可能疾病基因组学第9页人类基因组由30多亿个碱基对组成，负责储存人类全部遗传信息。

HGPprojectistodeterminethesequencesofthe3billionchemicalbasepairsthatmakeuphumanDNA.遗传图谱物理图谱序列图谱基因图谱GeneticMapPhysicalMapDNASequenceGeneIdentification

解读人类遗传信息Touncodethegeneticinformationofhuman......HGP计划内容疾病基因组学第10页国际人类基因组单体型图计划(HapMapProject)11

人类基因组99.9%相同，个体间差异只有0.1%。Thereare0.1%differentbetweentwoindividuals.单体型图计划为研究复杂疾病易感基因提供了公共突变数据库。TheHapMapprojectestabllishahumancommongeneticvariantsdatabasesforgeneticstudiesofcomplexdisease.

寻找人群中遗传差异Toidentifygeneticdifferencesinpopulation...HapMapPhaseI:1.3Mmarkersin269peopleHapMapPhaseII:+2.8Mmarkersin270people疾病基因组学第11页疾病基因组学：在全基因组水平，判定与疾病相关、造成基因编码产物结构、数量、活性等改变基因序列变异或修饰改变、及其致病机理研究。基因结构改变、表观遗传学改变、……疾病基因组学第12页Cytogenetics细胞遗传学DNASequenceDNA序列基因结构改变——遗传变异：单个碱基变异——点突变、单核苷酸多态性(SNPs)Singlebase-pairchanges–pointmutations、SNPs(SingleNucleotidePolymorphisms:3Mbdiff.betweenanytwogenomes;0.1%)小片段插入/缺失——移框突变，微卫星...Smallinsertions/deletions—frameshift,microsatellite,minisatellite...Mobileelements—retroelementinsertions(300bp-10kb)较大片段基因组变异（重复、缺失、扩增）Large-scalegenomicvariation/DeletionsandAmplifications(>10kb)基因组拷贝数变异(CNVs)SegmentalDuplications/deletions//CNVs(CopyNumberVariation,Upto15Mbdiff.betweenanytwogenomes,3%)染色体变异——易位、倒位、融合基因...Chromosomalvariation—translocations、inversions、fusions...疾病基因组学第13页基因组拷贝数变异

(CopyNumberVariations,CNVs)14

——基因拷贝数变异(CopyNumberVriations)是指在人类基因组中广泛存在，从1000bp碱基对到数百万bp范围内缺失、插入、重复和复杂多位点变异。

——拷贝数变异”(CNVs)和“单核苷酸多态性”(SNPs)是人类表型变异两个主要潜在起源。——本试验室在儿童孤独症（Autism）研究中发觉一例CNVs变异。——Redonetal.Nature疾病基因组学第14页拷贝数变异在人类基因组中广泛存在——CopyNumberVariations(CNVs)areubiquitousinthehumangenomeSurprisingly！CopyNumberVariationsaffects12percentofthegenome!——muchmorethansuspected!

270个个体Examining270individuals;共发觉1,447个拷贝数变异Atotalof1,447copynumbervariableregions；占人类基因组12%Encompass360megabases,12%ofthegenome).——Redonetal.Nature疾病基因组学第15页表观遗传学(Epigenetics)

16表观遗传学改变——指在细胞核DNA序列没有改变情况下，基因功效发生可逆、可遗传改变。DNA甲基化（Methylation）：在成熟体细胞中，DNA甲基化修饰普通发生于CpG双核苷酸；大约1%DNA受到了甲基化调控；是一个表观遗传学机制，能在不改变DNA序列前提下改变遗传表型。组蛋白修饰：组蛋白对特定氨基酸修饰，经过蛋白质和染色质相互作用改变染色质结构（称为染色质构型重塑），调控基因表示。非编码RNA（microRNAs）；一个长约21～23个核苷酸非编码RNA分子，能够经过结合到mRNA调整其它基因表示。疾病基因组学第16页遗传变异造成疾病机制蛋白质结构改变蛋白质活性改变剂量效应融合蛋白形成……疾病基因组学第17页1.基因选择性转录表示调控DNA甲基化、基因组印迹、染色体重塑...2.基因转录后调控1)非编码RNA:2)MicroRNA3)Antisense4)......3.蛋白质翻译后修饰1)组蛋白甲基化和乙酰化——Static2)组蛋白其它修饰——Dynamic3)非组蛋白共价修饰表观遗传原因造成疾病机制疾病基因组学第18页DNA甲基化是最早发觉修饰之一，能引发染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式改变，从而控制基因表示。E.g：DNA超甲基化遏制转录、引发基因失活。甲基转移酶催化DNACG两个核苷酸胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因5‘-CG-3’序列。生物体甲基化方式是稳定,甲基化位点可随DNA复制而遗传。甲基化与肿瘤：(1)整个基因组甲基化程度很低;(2)一些抑癌基因错误发生甲基化被缄默.甲基化（DNAMethylation）疾病基因组学第19页二、疾病基因组学研究策略与技术疾病基因组学第20页定位克隆候选克隆全基因组测序全基因组关联研究（SNPs,CNVs）全基因组表观遗传学研究……惯用策略疾病基因组学第21页定位克隆是最通常采取判定疾病致病基因策略：即依据基因在基因组上位置定位并克隆基因，已经被成功用来判定致病基因或为预测疾病提供主要依据。定位克隆研究策略疾病基因组学第22页CNLMG经过与遗传标识连锁定位致病基因位置。疾病基因组学第23页候选克隆研究策略基因功效、结构已经有研究预测可能疾病突变检测疾病基因组学第24页全基因组测序研究策略全基因组序列全外显子组序列全转录组序列第二代测序技术第三代测序技术海量数据分析判定疾病相关基因疾病基因组学第25页选择tagSNPs标识单体型在病例-对照人群间比较SNPs等位基因频率全基因组关联统计分析，得出有意义SNPs另外选择独立病例-对照人群对初筛阶段结果进行验证全基因组关联分析HapMap计划初筛阶段重复验证阶段利用芯片对全部tagSNPs进行基因分型疾病基因组学第26页全基因组表观遗传学研究策略病人组织

DNA正常组织

DNABisulfite处理Padlock介导特异DNA捕捉第二代DNA测序MeDIP富集甲基化基因组片段生物芯片杂交海量数据分析疾病基因组学第27页三、疾病基因组学研究进展与应用疾病基因组学第28页一个精神分裂症家系致病基因定位

疾病基因组学第29页

精神分裂症是以基本个性改变，思维、情感、行为分裂，精神活动与环境不协调为主要特征一类最常见精神病。患者普通无意识和智能方面障碍。疾病基因组学第30页主要特征：幻觉、妄想、认知障碍约占全部成人精神疾患70%；全球发病率约为1%；

中国：1986年调查，发病率为5.69‰

1998年张维熙等，终生患病率6.55‰患病率呈显著上升趋势；病情重复发作，病人本身很痛苦；巨大经济负担、社会问题。疾病基因组学第31页Gottesman等对1921年到1987年在欧洲人中研究综合分析后认为：同卵双生子同病一致率为48%，二卵双生子同病一致率为17%，不一样亲缘系数同病一致率不一样，而普通人群中仅1%。Cardno等综述了1995年以来欧洲和日本5个研究汇报发觉：精神分裂症患者单卵双生同胞同病一致率为41-65%，而二卵双生同胞同病一致率为0-28%疾病基因组学第32页一个来自河南省精神分裂症家系，该家系29名组员，有患者9人，5男4女。全部患者都属于精神分裂症同一亚型——偏执型。有一人（IV-7）表型不能确定。疾病基因组学第33页常染色体显性遗传模式下两点LOD>1位点

疾病基因组学第34页D12S345，D12S85和D12S364附近D12S1631，D12S1643，D12S1621等8个微卫星标识进行精细定位。同时，该家系中4个组员：IV-1、IV-15、IV-16和IV-17样本被采集到，一并加入到精细定位研究中。

精细定位疾病基因组学第35页MarkersPositionLinkageGeneHunter(cM)Single-pointMultipoint

Zmaxθ=LODNPLp-valueLODNPLp-valueD12S36430.601.990.060.852.880.00977-1.120.120.20459D12S158030.601.120.14-1.510.10.21387-1.350.110.21387D12S161744.030.280.20-1.640.240.14502-1.431.040.06787D12S163150.900.80.13-0.281.310.052730.955.440.00879D12S164350.902.510.002.586.890.000980.965.450.00879D12S162152.202.330.002.435.660.006840.965.450.00684D12S164852.541.540.080.392.130.015140.965.450.00879D12S34553.091.710.080.622.890.008790.965.450.00879D12S169253.280.50.230.271.850.018070.965.450.00879D12S166855.291.140.000.950.470.091312.619.950.00098D12S168755.740.230.000.760.850.071292.6910.830.00098D12S8561.341.440.090.721.670.034180.531.610.03662家系SCZ32在Chr.12参数分析与非参数分析结果疾病基因组学第36页疾病基因组学第37页

为了验证该位点，我们又搜集另外15个精神分裂症家系进行深入研究。

疾病基因组学第38页MarkersPositionLinkageGeneHunter(cM)Two-pointMultipoint

ZmaxQ=HLODNPLp-valueHLODNPLp-valueD12S36430.600.710.160.381.340.088580.031.470.07020D12S158030.600.160.310.010.560.278820.031.440.07504D12S161744.030.860.160.991.600.055240.611.970.02634D12S163150.901.160.140.441.250.103992.94

3.500.00183D12S164350.901.910.081.332.620.006831.842.860.00432D12S162152.200.360.250.000.980.159290.000.990.15668D12S164852.540.240.750.000.230.399460.030.980.15886D12S34553.090.180.350.030.190.415140.000.820.7D12S169253.280.220.320.000.490.303740.000.720.23010D12S166855.290.070.780.000.720.229500.001.140.12367D12S168755.740.440.180.141.090.135610.001.670.04852D12S8561.340.100.330.001.080.136860.001.460.07251其它15个精神分裂症家系Chr.12参数分析与非参数分析结果疾病基因组学第39页MarkersPositionLinkageGeneHunter(cM)Two-pointMultipoint

ZmaxQ=HLODNPLp-valueHLODNPLp-valueD12S36430.602.630.101.032.020.023890.001.460.07007D12S158030.601.110.210.000.570.271060.001.420.07512D12S161744.031.090.180.761.610.052920.402.170.01771D12S163150.901.960.140.341.540.060613.904.750.00119D12S164350.904.15

0.053.764.260.001692.674.130.00183D12S162152.201.800.161.522.360.012180.152.320.01317D12S164852.541.220.210.000.750.213870.402.310.01340D12S34553.091.350.230.180.910.172600.292.150.01838D12S169253.280.970.220.000.940.165120.252.060.02222D12S166855.290.700.180.240.810.197621.633.600.00256D12S168755.740.600.160.561.260.098561.734.330.00161D12S8561.341.020.210.151.460.069370.011.810.03599全部16个精神分裂症家系Chr.12参数与非参数分析结果疾病基因组学第40页银屑病全基因组关联研究疾病基因组学第41页银屑病（Psoriasis,MIM:177900）亦称“牛皮癣”，是一个慢性炎症性皮肤病出现特征性皮损：大小不等红斑样丘疹，表面覆盖着银白色鳞屑，可发生于身体任何部位，好发于头皮、躯干及四肢伸侧。是一个常见且严重皮肤病。银屑病主要临床表现疾病基因组学第42页银屑病在全世界发病率约为0.6~4.8%Psoriasisoccursin0.6~4.8%oftheworld’spopulation在亚洲和美洲人发病率在0.4%~0.7%;欧洲人中发表率略高，最高到达4.6%；据预计我国银屑病患者已靠近1，000万。银屑病有2个发病高峰：

一次是在20-30岁，一次是50-60岁。银屑病发病率银屑病主要病理改变表皮增厚皮损和出血淋巴细胞炎性浸润疾病基因组学第43页银屑病病理机制研究当前发觉主要银屑病易感基因均与免疫系统相关：主要组织相容性复合体(Themajorhistocompatibilitycomplex，MHC)组织相容性抗原(HistocompatibilityAntigens，HLA)HLA-Cw6HLA-B13,-B17,-B37,-Bw16T淋巴细胞介导(T-lymphocyte-mediatedmechanism)疾病基因组学第44页初筛阶段重复验证阶段合并2个阶段数据统计分析芯片平台：Illumina610k病例1139，对照1132（汉族）64个P<10-5SNPs病例5182，对照6516（汉族）提醒3个可能易感基因：MHC、IL12B、LCE发觉6个关联SNP，分别位于3个基因上病例539，对照824（维吾尔族）Sequenomiplex银屑病全基因组关联分析（GWAS）研究结果样本选择疾病基因组学第45页疾病基因组学第46页10-5研究结果：一、证实了两个之前已被证实易感位点：

MHC(rs1265181,P=1.93×10-208)

IL12B(rs3213094,Pcombined

=2.58×10-26)二、发觉了一个新银屑病易感基因位点：LCEgenecluster——on1q21(rs4085613,Pcombined=6.6910-30)疾病基因组学第47页经过第一阶段GWAS分析发觉MHCregion与中国人群银屑病发生显著相关：

MHC区间位于chr.6:25～34Mb该研究共选择了位于该染色体区间2,087个SNPs——左图显示了关联研究证实：9个SNPs

7个已知基因其中红色箭头标示——rs130065位于已知银屑病易感基因PSORS1：CDSN附近；该基因

属于HLA-C基因家族。疾病基因组学第48页经过GWAS连锁分析发觉——除MHC区域之外得到最强关联4个SNPs均位于1q21：LCE基因家族（rs4112788,rs4845454,rs4085613,rs1886734）。左图显示了LCE基因家族区域附近基因和LD连锁图：—上图显示全部位于区间内基因—中图和下列图分别显示了依据中国人和欧洲人基因频率绘制LD连锁图左图黄色箭头显示rs6701216位点，该SNP被其它研究重复与银屑病相关。疾病基因组学第49页LCE基因家族与银屑病♣LCE家族编码：角质包膜蛋白——在表皮终末分化过程发挥了主要作用。

该研究假设因为LCE易感基因变异造成表皮角质包膜异常、角质细胞分化异常，从而影响银屑病发生。疾病基因组学第50页Follow–UPStudyofPsoriasisGWAS银屑病二期GWAS研究♣第二阶段GWAS研究使用样本中国人：8312患者+12919对照；高加索人：3293患者+4188对照+254关键家系发觉6个新银屑病易感位点疾病基因组学第51页参加国家：美国、中国、瑞典、新加坡疾病基因组学第52页银屑病GWAS后续研究策略——更大规模（不一样人种）样本验证生物信息学分析判定潜在致病Alleles多层次功效学验证分子水平、细胞水平、动物模型...揭示银屑病分子致病机制经过GWAS研究提醒与疾病关联SNPs...疾病基因组学第53页孤独症CNVs研究疾病基因组学第54页儿童孤独症简称孤独症（Autism；又称自闭症）是一个严重影响儿童神经发育性障碍疾病基因组学第55页孤独症介绍孤独症起病于婴幼儿期，男童发病率高于女童；不一样程度社会交流障碍是孤独症关键特征；回避眼神接触，对亲呢动作反应冷淡，孤僻，对同伴交往或集体活动缺乏兴趣；多数患儿表现语言发育迟缓，部分表现为语言形式和语音利用方面异常；兴趣与活动内容局限、刻板、重复；约有四分之三患儿伴有显著精神发育迟滞；有部分孤独症患儿在普通性智力落后背景下又出现“孤独性才能”，在音乐、计算、推算日期、机械记忆和背诵等方面展现特殊才能。疾病基因组学第56页孤独症病因学研究概况流行病学研究显示，遗传原因、脑器质性原因、神经生化原因、孕产期病变、感染及免疫等多方面原因可能与孤独症相关，其中遗传原因为大多数科学家所公认。据报道，同卵双生共患孤独症几率为60-80%，异卵双生共患几率为3-10%，同胞患孤独症几率为3-5%，是群体中孤独症发病率50-100倍。依据以上孤独症家族聚集性、患者同胞再患危险度和同卵双生、异卵双生共患差异推断：90%以上孤独症是由遗传造成。疾病基因组学第57页孤独症已成为全球性公共健康问题AutismPrevalenceonTheRise患病率急剧上升年，美国0.9%，其中男童1/70年，英国1.57%，日本1.6%年，韩国2.6%全球患者数6700万儿童患孤独症人数超出儿童癌症、糖尿病、艾滋病三者总和年12月18日，联合国确立每年4月2日为世界孤独症日。这是继“世界爱滋病日”之后联合国确定第2个疾病日疾病基因组学第58页孤独症CNV研究策略疾病基因组学第59页全基因组SNP分型及数据整理疾病基因组学第60页罕见CNV分析疾病基因组学第61页以CNV研究为基础基因关联研究新发CNV/来自于亲本罕见CNV区域中与疾病相关候选基因举例疾病基因组学第62页CNV区域候选基因功效研究与疾病相关微缺失区域中基因家族一览疾病基因组学第63页疾病相关主要基因家族详图疾病基因组学第64页ASD相关基因功效图谱疾病基因组学第65页米勒综合症全基因组测序研究66疾病基因组学第66页Millersyndrome米勒综合症(Millersyndrome)(MIM#263750)造成患者口、眼、耳、足等畸形遗传病严重小颌症唇腭裂四肢末端发育不良或不发育眼睑缺损多乳头疾病基因组学第67页研究策略

受累个体及正常对照外显子组测序

dbSNP和HapMap过滤适当筛选策略找到候选基因Sanger测序验证候选基因突变疾病基因组学第68页69BackgroundDNAGenomicDNAFragment

&addlinkersHybridizeNimbleGenArrayWashEluteSequencingProbesTargetDNATargetDNAExon1Exon2Exon3Exon4Exon5Exon6Amplification疾病基因组学第69页DenaturationwithNaOHbeforeaddingtoFCInitialextensionwithTaqPolymerase疾病基因组学第70页疾病基因组学第71页DenaturationwithformamideSubsequentamplificationwithBstpolymerase35cyclesat60oC疾病基因组学第72页5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTA FirstbaseincorporatedCycle1: Addsequencingreagents Removeunincorporatedbases DetectsignalCycle2-n:AddsequencingreagentsandrepeatAllfourlabelednucleotidesinonereactionHighaccuracyBase-by-basesequencingNoproblemswithhomopolymerrepeatsSequencingBySynthesis(SBS)疾病基因组学第73页TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages.123789456疾病基因组学第74页样本选择

3个多发家系，家系间无亲缘关系，父母表型正常，都有两个患病后代正常对照为8个Hapmap个体3个家系之间没有亲缘关系疾病基因组学第75页研究方法与结果方法

3个家系4个受累个体（家系1-A，家系1-B，家系2，家系3）外显子组测序。结果取得数据平均5.1Gb/人，捕捉26.6Mb外显子区域其覆盖率到达40倍，覆盖了该区域97%序列

疾病基因组学第76页怎样过滤和筛选数据？两个模型Dominantmodel

最少应有1个位于同一基因NS/SS/I突变，且覆盖率应为40倍以上Recessivemodel最少应有2个位于同一基因NS/SS/I突变且覆盖率应>500倍

无义突变（NS）剪接位点突变（SS）插入/缺失(indels;I)疾病基因组学第77页过滤和筛选数据家系1中1-A，1-B中过滤掉dbSNP和HapMap中常见突变

Dominantmodel：228Recessivemodel：9家系1与家系2和3（均过滤dbSNP和HapMap）比较

Dominantmodel：26Recessivemodel：onlyasinglegene,DHODH

疾病基因组学第78页过滤和筛选数据NS/SS/I突变是否有危害Recessivemodel中DHODH并未入选Dominantmodel中DHODH

在家系1中发觉G605A（与疾病无关），但G454A可能与疾病相关。但每个个体DHODH

新发突变均为复合杂合子，且6个突变中5个可能与疾病相关，所以仍考虑该疾病为Recessivemodel。疾病基因组学第79页过滤和筛选数据---结果SarahBNgetal.疾病基因组学第80页Sanger测序验证候选基因突变

方法

筛查另