目的基因的获取专家讲座

第四章目标基因获取目标基因：准备要分离、改造、扩增或表示基因。目的基因的获取专家讲座第1页第一节基因组DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不一样大小片断。酶切目的基因的获取专家讲座第2页因为带有粘性末端，产物能够直接与载体连接。1.优点2.缺点目标基因内部也可能有该内切酶切点。目标基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene目的基因的获取专家讲座第3页二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶用量和消化时间，使基因组中酶切位点只有一部分被随机切开。①内切酶识别位点碱基数影响所切出产物长度和随机程度。（1）限制性内切酶选取标准目的基因的获取专家讲座第4页1）4bp内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②内切酶粘性末端能与惯用克隆位点相连。（Sau3A—BamHI）目的基因的获取专家讲座第5页2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb随机片断。目的基因的获取专家讲座第6页1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因构想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因论文。第二节化学合成目标基因一、当前惯用方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。目的基因的获取专家讲座第7页①保护dNTP5’端P或3’端-OH③用酸或碱脱保护（1）原理1.磷酸二酯法②带保护单核苷酸连接确保合成反应定向进行。带5’保护单核苷酸与带3’保护另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。目的基因的获取专家讲座第8页（2）合成过程下一个5’端保护单核苷酸又能够同3’端保护二核苷酸聚合。目的基因的获取专家讲座第9页原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法目的基因的获取专家讲座第10页将第一个核苷酸3’-OH端固定在固相支持物上。固相磷酸三酯合成法是当前通用合成方法。15合成二核苷酸连接处有三个酯键！目的基因的获取专家讲座第11页固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最终脱保护固相支持物固相支持物C目的基因的获取专家讲座第12页化学合成DNA片断普通在200bp以内。二、化学合成DNA片断组装用T4多核苷酸激酶使各个片段5’端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成片断之间都有互补区域，不一样片断之间互补区域能形成有断点完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成DNA单链5’端是-OH）目的基因的获取专家讲座第13页T4DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整DNA双链（3）连接酶连成完整双链目的基因的获取专家讲座第14页2.互补延伸连接法预先设计片断之间有局部互补区，能够相互作为另一个片断延长引物，用DNA聚合酶延伸成完整双链。3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物目的基因的获取专家讲座第15页1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA含量很低，极难作cDNA3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低目的基因的获取专家讲座第16页DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor目的基因的获取专家讲座第17页将某种生物细胞整个基因组DNA切割成大小适当片断，并将全部这些片断都与适当载体连接，引入对应宿主细胞中保留和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体全部基因，称为基因文库。一、基因文库构建1.基因文库（genelibrary）第三节目标基因保留和扩增目的基因的获取专家讲座第18页（2）当前惯用载体2.构建基因文库载体选取载体能够容载DNA片断大小直接影响到构建完整基因文库所需要重组子数目。载体容量越大，所要求DNA片断数目越少，所需重组子越少。（1）对载体要求载体系列：容量为24kpcosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb目的基因的获取专家讲座第19页断点完全随机，片断长度适当于载体连接。不能用普通限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段制备3.基因文库构建普通步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb随机片断。②酶切法：目的基因的获取专家讲座第20页（2）载体与基因组DNA大片段连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段两个末端都有相同粘性末端。如：Sau3A与BamHI酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成限制性内切酶粘性末端片断。目的基因的获取专家讲座第21页各种酶接头能够向企业定做或购置。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③同聚物加尾目的基因的获取专家讲座第22页目的基因的获取专家讲座第23页4.基因组文库大小一个文库要包含99%基因组DNA时所需要克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA概率（99%）f:插入载体DNA片断平均长度占整个基因组DNA百分数N：所需重组载体数（克隆数）目的基因的获取专家讲座第24页比如：人基因组是3×109bp，插入DNA片断平均长度假如是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105目的基因的获取专家讲座第25页1.cDNA以mRNA为模板逆转录出DNA称cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文库构建mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物利用某种生物总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保留和扩增，称cDNA文库。目的基因的获取专家讲座第26页（1）不含内含子序列。（2）能够在细菌中直接表示。（3）包含了全部编码蛋白质基因。（4）比DNA文库小多，轻易构建。4.构建cDNA文库普通步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库特点提取总RNA有商业化试剂盒（kit）。目的基因的获取专家讲座第27页分离mRNA用商业化OligodT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA1%-2%。（2）mRNA分离纯化①原理②mRNA分离纯化Column（柱）目的基因的获取专家讲座第28页目的基因的获取专家讲座第29页反转录酶（3）cDNA合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物目的基因的获取专家讲座第30页用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA第一链3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH碱目的基因的获取专家讲座第31页剩下cDNA单链3’末端普通形成一个弯回来双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链5’cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’3’③cDNA第二链合成目的基因的获取专家讲座第32页④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1能够切掉发卡结构（但这会造成cDNA中有用序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’3’cDNA第一链cDNA第二链5’3’5’3’目的基因的获取专家讲座第33页目的基因的获取专家讲座第34页这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH小片断恰好成为DNA聚合酶引物，用来合成冈崎片断。DNAPolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。目的基因的获取专家讲座第35页mRNAcDNA3’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’5’引物mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’RNaseHDNAligase去引物目的基因的获取专家讲座第36页目的基因的获取专家讲座第37页在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶目的基因的获取专家讲座第38页目的基因的获取专家讲座第39页6.cDNA文库大小一个cDNA文库要包含99%mRNA时所需要克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA概率（99%）:某一个低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA百分比N：所需重组载体数（克隆数）1n1n目的基因的获取专家讲座第40页三、文库查询（screening）用目标基因探针与文库中重组载体进行Southernblot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析目的基因的获取专家讲座第41页第四节目标基因分离和扩增一、目标基因分离1.探针柱分离特异mRNA依据已知基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因mRNA。富集特定基因mRNA或cDNA模板。目的基因的获取专家讲座第42页纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNATotalmRNA纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA过柱与探针碱基互补mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特异mRNA洗脱RT-PCR目的基因的获取专家讲座第43页2.mRNA消解杂交原理：羟基磷灰石柱结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatitecolumn）目的基因的获取专家讲座第44页从表示A蛋白和不表示A蛋白组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表示A蛋白mRNA合成cDNA第一链。再同不表示A蛋白总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交cDNA就包含特异表示A基因cDNA单链。用羟磷灰石柱搜集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。目的基因的获取专家讲座第45页AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白AmRNA不含蛋白AmRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白AcDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱BAPCR16cDNA文库目的基因的获取专家讲座第46页3.mRNA差异显示PCR（DDRT-PCR）mRNAdifferentialdisplayRT-PCR（1）3’端锚定引物Oligo(dT)引物3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTTM：A、GorCN:A、G、TorC5’3’目的基因的获取专家讲座第47页（2）12种锚定引物AGTTTTTTTT5’3’CGTTTTTTTT5’3’GGTTTTTTTT5’3’TGTTTTTTTT5’3’AATTTTTTTT5’3’CATTTTTTTT5’3’GATTTTTTTT5’3’TATTTTTTTT5’3’ACTTTTTTTT5’3’CCTTTTTTTT5’3’GCTTTTTTTT5’3’TCTTTTTTTT5’3’目的基因的获取专家讲座第48页（3）5’端随即引物10mer

AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3’5’NMTTTTTTTT5’3’扩增cDNA第一链。RTNMTTTTTTTT5’cDNA3’NNNNNNNNNN5’3’NNNNNNNNNN5’3’cDNA第二链，并PCR目的基因的获取专家讲座第49页（4