文献翻译NUB1是加强蛋白降解的变异亨廷顿蛋白毒性抑制剂的确认

文献题目：IdentificationofNUB1asasuppressorofmutantHuntingtintoxicityviaenhancedproteinclearanceNUB1是加强蛋白降解的变异亨廷顿蛋白毒性抑制剂的确认BoxunLu1,2,IsmaelAl-Ramahi3,4,AntonioValencia5,6,QiongWang2,FradaBerenshteyn2,HaidiYang2,TatianaGallego-Flores3,4,SalahIchcho2,ArnaudLacoste2,MarcHild2,MarianDiFiglia5,6,JuanBotas3,4&JamesPalacino2亨廷顿舞蹈症是由HTT基因中的CAG重复序列异常延长引起的，导致变异HTT蛋白（mHTT）功能增强，产生毒性。减少mHTT蛋白的量被认为是介入治疗的一种策略。我们进行了全基因组RNA干扰筛选以寻找调控mHTT数量的基因，并识别出13个基因。我们在一个亨廷顿舞蹈症果蝇模型中对其中10个进行了体内实验，其中6个显示出与体外筛选结果一致的活性。在这6个基因中，泛素样蛋白1阴性调节酶（NUB1）过表达降低了神经元模型中的mHTT含量，挽救了mHTT导致的细胞死亡。NUB1减少mHTT含量是通过加强多泛素化，以及蛋白酶体对mHTT蛋白的降解完成的。这一过程需要CUL3和泛素样蛋白NEDD8（该蛋白为激活CUL3所必须）的参与。作为一种调节NUB1用于治疗的可能的途径，β-干扰素通过诱导NUB1降低了mHTT含量并挽救了神经元毒性。因此，通过高通量筛选我们已经识别出调节内源性mHTT的基因，并证明了NUB1是干预性治疗亨廷顿舞蹈症的示范性切入点。亨廷顿舞蹈症是一种常染色体显性遗传的不可治愈疾病，是一种神经退行性疾病。该疾病病因是HTT基因外显子1的CAG重复序列异常扩增，导致表达出含有超过最多36个谷氨酰胺多肽链的变异HTT蛋白（mHTT）。尽管野生型HTT蛋白具有神经保护作用，毒性mHTT功能的增加，而不是野生型HTT蛋白活性的丧失，才是该疾病的主要病因。mHTT蛋白的表达导致神经元死亡，机理是破坏诸如转录、轴突运输、胞吞胞吐和钙平衡等细胞活动。尽管这些活动的平衡对于细胞存活极为重要，病因背后的真相依然不甚明朗。HTT会发生翻译后修饰，包括一些酶促反应，例如蛋白酶解、磷酸化或有泛素或泛素样蛋白参与的修饰。尽管这些翻译后修饰可能调控HTT的正常和病理性功能，究竟什么反应对涉及神经毒性的通路有影响依然不得而知。考虑到HTT蛋白生物学性质的复杂性，根据已报道的证据我们猜测在诸多病理表型的上游某一点靶向定位HTT蛋白能够减少下游环节的任何毒性。在一只可诱导mHTT老鼠中，关闭转基因表达扭转了神经毒性和运动缺陷，而在哺乳动物模型中针对mHTT导入小发卡RNA（shRNA）或小干扰RNA（siRNA）缓解了神经毒性和疾病相关的表型。因此，降低mHTT量来缓解任何下游毒性，从而可能提供一种有效的治疗亨廷顿舞蹈症的途径，并且识别调控mHTT的通路是研究非常感兴趣的。之前的筛选已经研究了mHTT生物活性的不同方面，例如与之相互作用的蛋白、蛋白聚合调节物和负责降解蛋白的各种蛋白酶。虽然这些研究展现了mHTT生物活性的重要方面，但据我们所知尚没有无偏筛选mHTT蛋白水平本身的基因调控物的报道。HTT复杂的生物活性对这样的努力是一种阻碍。首先，因为存在蛋白降解和聚合所以对mHTT进行定量很复杂。其次，HTT的清除受到多种通路的调控，例如自吞噬和蛋白酶体。这样的复杂因素使得在多种模型中确定HTT含量的变化成为必须要做的事。此外，RNAi筛选存在脱靶活性的风险。为了说明以上这些，我们设计了流程图以最小化假阳性结果。我们首先使用了能检测所有含有多聚谷氨酰胺重复序列的mHTTN-端片段的抗体，运用均相时间分辨荧光（HTRF）技术确认了靶点（补充图1a）。我们确认了在不同物种模型体内和体外实验的结果，以识别进化上保守的位点。对于那些我们感兴趣的特殊位点，我们在多种模型中用多种抗体进一步研究了不同种类的mHTT，确保mHTT含量的减少是显著的。我们的筛选研究识别出13种mHTT含量的调控物，其中大多数显示出与一个果蝇模型种的表型反应一致的结果。其中，我们的数据显示NUB1（一种与HTT相互作用的蛋白）调控着mHTT的水平和毒性。并且我们进一步找到了一种由NUB1调控的mHTT含量的变化机制，这也证明了定位NUB1治疗亨廷顿舞蹈症的方法。据我们所知，本研究首次报道了寻找mHTT含量调控基因的全基因组筛选。NUB1和其他调控HTT含量的位点得到证实，为治疗亨廷顿俄舞蹈症提供了基础数据和入手点。结果全基因组筛选可溶性mHTT清除我们使用果蝇S2R细胞系进行全基因组筛选。该实验体系成熟，可用于各种RNAi筛选，包括一种寻找mHTT聚合物的筛选。我们建立了一条S2R细胞系，该细胞系表达了metallothioneinpromoter-driven含573个氨基酸残基（其中谷氨酰胺重复序列数达到73，并带有C端β1表位）的HTT蛋白片段。我们选择这一片段是因为更短的片段倾向于形成聚合物，而更长的片段会发生多重蛋白酶解反应。这两种情况都会大幅增加检测可溶性HTT的复杂性。表达的mHTT片段由westernblot和HTRF检测（配合胞外铜离子诱导）（补充图1b、c）。为了尽可能减小来自可诱导promoter的定位于转录的位点数，我们在一个蛋白降解模型中进行筛选（其中诱导与应用于RNA干扰的dsRNA同时结束）。mHTT的含量在没有从头测序的情况下进行，使我们能同时检测mHTT降解的促进物和抑制物（图1a）。初步的筛选使用了两个全基因组dsRNA库（AmbionandBKNHeidelberg2，覆盖了超过97%的果蝇基因组）。我们通过Z分（见实验方法）（图1b、c）和复筛选择初步筛选的位点（图1b）。如此，我们得到了554个基因作为mHTT降解的调控基因。在患者成纤维细胞中第二次确认基于序列对比算法可知，在这554个基因中，363个基因有人类同源基因。这363个基因汇编成总共352个候选人类基因（补充表1）。我们在第二次筛选中评估了两种表达内源性全长mHTT蛋白的细胞作为模型的合适程度，分别为敲入基因STHdh的老鼠细胞和人类细胞（经永生化处理的亨廷顿舞蹈症患者成纤维细胞）。两者转染siRNA的情况均为良好，并在westernblot中显示出高效的HTT蛋白敲除结果（补充图2a、c）。然而对于HTRF检测结果，老鼠细胞显示与westernblot结果不一致（补充图2a、b），这使得该模型不适合高通量确认实验。同样的不一致也出现在我们检测老鼠HTT蛋白或其他老鼠细胞模型（例如老鼠胚胎干细胞发育出的细胞或来自基因敲入老鼠的初级神经元）的敲入杂合等位基因的时候（数据未提供）。相反，患者的成纤维细胞在测试HTT敲除时westernblot与HTRF结果显示出关联性。多聚谷氨酰胺选择性抗体（MW1，在线实验方法）让我们能在一高通量模式中有倾向地检测mHTT（补充图2c）。因此，我们使用来自两位患者的永生化处理过的成纤维细胞用于确认实验。两种细胞分别带有编码含45和68个谷氨酰胺重复序列蛋白的mHTT等位基因（图2a、b）。我们测试了之前第一轮筛选得到的352个位点，两个患者成纤维细胞系中的mHTT信号是相互关联的（R2=0.68，图2b），表明大多数基因对mHTT的影响并非由于遗传背景的缘故。我们之后对那些在两种细胞系中重复地、持续地改变mHTT含量地位点进行了几次反筛选（例如细胞通透性和对照蛋白（中心粒运动神经元－2存活，SMN2）含量）（图2a、c、d）。在这之中，14个位点显示出对mHTT含量持续性、选择性和定位靶向的影响（补充图3a）。我们还在永生化处理的野生型成纤维细胞中用HTRF技术及2B7-Tb/2166-D2抗体对（在线实验方法）检测了野生型HTT含量。只有一个位点（KLHL22）显著调控了野生型HTT含量（补充图3a）。在果蝇亨廷顿舞蹈症模型中进行体内确认为了在体内评估这13个位点的病理生理联系，我们使用了一个设计良好的果蝇模型。这些果蝇携带一个可诱导的转基因，编码N端的由1～336个氨基酸残基组成的一段mHTT序列，包含128个谷氨酰胺重复序列（代号为NT-HTT128Q），用GAL4-UAS系统表达。NT-HTT128Q在神经系统中的表达（使用elav-GAL4）会诱导一种可重复的、可定量的启动子表现损伤，该损伤可由能沿玻璃圆柱壁向上爬的NT-HTT128Q型果蝇百分比定量测量，对照组为无NT-HTT128Q的elav-GAL4果蝇（图3a-f）。我们获取了所有公开方式可得到的携带与我们筛选所得的基因相对应的过表达或失能等位基因的果蝇株型（补充图3a）。3个位点的同源基因（SSRP、KLK14、NPR1）没有经过测试，因为我们进行筛选时没有获得相关的株型。经过测试的10个同源位点中，六个（NUB1,VEGFC,SEC61B,SEC61G,LAP3和KLHL22）调控了NT-HTT128Q诱导的爬行障碍，与在细胞中观察到的蛋白改变所预测的一致（图3a-f；KLHL22未显示，因为将其杂交入果蝇时引起了毒性和果蝇过早死亡，影响了精确测量爬行障碍）。一个位点未显示调控作用（RAE1），三个位点（PICALM,CDA,TRAPPC9）显示与细胞筛选结果不符的改变（结果未显示）。我们之后利用HTRF技术监测了这些果蝇体内的NT-HTT128Q蛋白水平。与体外实验结果一致的是，我们发现CG15445或CG7103（分别为NUB1和VEGFC的果蝇同源基因）缺乏会导致NT-HTT128Q蛋白水平上升（图3g、h）。这表明这两个基因影响mHTT的机制在动物体内也是活跃的。NUB1抑制果蝇体内mHTT毒性两个基因中的一个，即NUB1，在行为学和HTRF实验中显示出一致的结果，并且生理上与mHTT存在相互作用。NUB1主要在大脑中表达，通过胞外干扰素-β（IFNβ）处理可以被诱导。CG15445（NUB1的同源基因）shRNA似乎能加剧NT-HTT128Q诱导的启动子损伤，但本身表型并不强。为了弄清NUB1和HTT之间的相互作用是否具有特异性，我们对表达了人类NUB1基因的转基因果蝇（控制为GAL4-UAS）进行了运动行为测试，以探究NUB1过表达能否抑制NT-HTT128Q诱发的神经退化。受测试的果蝇中五个转入了人类NUB1基因的不同株型显示了对NT-HTT128Q诱发的运动行为损伤的抑制（图4a，部分数据未显示），并且果蝇头部的NT-HTT128Q量显著减少（图4b）。为了在一个独立试验中确认我们的实验观察，我们评估了视网膜退化。结果显示人类NUB1在果蝇视网膜中的表达也抑制了NT-HTT128Q引起的细胞损失和视网膜萎缩，而CG15445对应shRNA的表达则加剧了视网膜疾病表型（图4c-f）。在哺乳动物模型中NUB1防止mHTT毒性的产生Westernblost结果确认，NUB1的siRNA减少了NUB1蛋白量，使Q68患者的成纤维细胞和STHdhQ7/Q111细胞的内源性HTT蛋白含量增加(Coriellch00096)。此外，在mHTT存在的情况下我们发现在上述细胞中NUB1对野生型HTT蛋白含量有着与mHTT相同的方向（补充图4a、b），尽管我们并没有在一株来自非患者的成纤维细胞对照系中观察到类似变化（补充图3a）。这一差异可能是由mHTT等位基因的存在或缺失导致。为了研究NUB1含量增加能否减少内源性HTT蛋白含量，我们将人类NUB1的cDNA转入STHdhQ7/Q111细胞。mHTT和野生型HTT含量均显著降低（47±_11%formHTTbyMW1westernblot,P=0.0011,n=7;49±_19%formHTTpluswtHTTby2B7westernblot,P=0.033,n=5;图5a）。HTT蛋白含量变化并非源自针对HTTmRNA的效应，因为不管是NUB1siRNA还是cDNA均没有改变HTT的mRNA量（图5a及补充图5a）。HTT蛋白含量变化也不是来自完全长度的HTT蛋白的降解或聚合，因为电泳条带中低分子量区域或不溶性区域都没有增加（补充图5a）。为了证实HTT含量减少是通过蛋白降解完成的，我们进行了非放射性脉冲－示踪实验来追踪HTT降解。NUB1过表达显著（P≤0.01）增加了HTT降解率，但没有对GAPDH产生影响（补充图5b）。用蛋白酶体抑制剂（MG132，补充图5b）阻碍了NUB1对HTT蛋白降解的增强作用，而细胞自噬抑制剂（巴弗洛霉素补充图5b）并没有这样的作用。这些结果表面，NUB1过表达增强了HTT蛋白的蛋白酶体降解。为了确定NUB1介导的mHTT含量变化是否影响了细胞毒性标记，我们使用了两种mHTT敲入模型。表达mHTT的STHdh增加了半胱氨基天冬氨酸水解酶3和／或7（caspase3and/or7）在应激条件下的活性，例如血清移除。NUB1过表达显著降低了血清移除－饥饿诱导的STHdhQ111/Q111细胞中的caspase3和／或7的活性（to63.7+1.5%，图5b），表明mHTT诱导的caspase活性受到抑制。我们也研究了来自HTT140Q/140Q敲入老鼠的初级皮层神经元细胞。在慢病毒感染5天后NUB1过表达显著降低了该细胞中的内源性mHTT水平（33.2±6.4%lower，图5c），而内源性野生型HTT蛋白在野生型神经元细胞中没有显著改变（9.4±5.8%lower，图5c）。与野生型神经元细胞相比，HTT140Q/140Q神经元细胞的内源性NUB1蛋白含量和NUB1过表达程度都升高了（图5c）。这可能表明存在一种mHTT的毒性诱导应激反应，这种反应或者增加了NUB1的表达或者稳定了NUB1蛋白，最终增强了mHTT的降解。之前的工作已经证明，经MTT检测，在培养10天后HTT140Q/140Q初级神经元的细胞通透性低于野生型神经元（MTT即3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐），见在线实验方法）。为了了解增加NUB1是否能保护HTT140Q/140Q神经元免于细胞死亡，我们用NUB1或对照（LacZ）的慢病毒感染了培养5天的野生型和HTT140Q/140Q神经元，并用MTT测试细胞通透性。培养10天后，未经处理的HTT140Q/140Q神经元细胞通透性低于野生型（图5c、d）。就生存情况而言，相比于未感染慢病毒（61.14±0.01%，指存活细胞数量占野生型神经元的比例，下同）和对照组（57.36±0.02%）的HTT140Q/140Q神经元细胞，感染了NUB1对应病毒的HTT140Q/140Q神经元显示出更高的存活率（81.82±0.01%）（图5d）。这些发现显示，哺乳动物神经元中的mHTT毒性可以通过NUB1含量增加来缓解，作用机制是降低mHTT含量。在人类胚胎干细胞（hESC）／诱导多能干细胞分化神经元中NUB1降低mHTT含量为了在人类神经元范畴中研究NUB1，我们使用了hESC分化神经元细胞（补充图6）。hESC分化神经元被短暂地转染了表达一个Q73mHTT外显子1（HTT-exon1-Q73）的结构体，时长为3天，而mHTT通过HTRF、westernblot或者免疫染色法检测。用HTRF加两组抗体对（4C9-Tb/MW1-D2）检测显示，cDNA共转染的NUB1过表达减少了mHTT含量（幅度达74.4±0.8%，图6a左），而另两组抗体对（4C9-Tb/4C9-D2）则检测到聚合的mHTT（98.5±0.8%，图6a中）。Westernblot结果与HTRF一致（图6a右）。此外，mHTT聚合物用抗体EM48通过免疫染色实现可视化（图6b）。在免疫染色与HTRF或westernblot得到的mHTT含量改变情况一致的结果中，NUB过表达降低了经EM48+免疫染色的神经元百分比（从8.5±0.9%降至1.5%±0.3%；图6b）。mHTT-NUB1转染的神经元中该百分比（43.6±1.6%）稍高于无NUB1共转染的HTT转染细胞（34.3±1.2%；图6b），这可能表明mHTT诱发的毒性得到降低。相比之下，当mHTT外显子1上所有的赖氨酸残基都突变为精氨酸（Q73_3R）时，NUB1介导的降低作用对mHTT无效（图6a、b），表明mHTT赖氨酸修饰可能参与了相关反应，并通过翻译后修饰机制协助了NUB1介导的mHTT含量降低过程。尽管hESC分化神经元能模拟人类神经元，但它过表达的是mHTT片段而非内源性全长mHTT。为了确认NUB1能否在人类神经元中清除内源性mHTT，我们培养了从患病者身上得到的诱导多能干细胞（iPSC）分化的神经元。与非定位对照组相比，在NUB1被siRNA敲除后细胞内mHTT水平显著升高（HTRF测得增幅为17.2±0.0%，图6c左）。此外，NUB1经慢病毒感染过表达后与LacZ对应慢病毒感染的细胞相比，mHTT含量显著降低（HTRF测得降幅为15.7±1.7%，图6c右），与未感染样本相比也有类似结果。mHTT含量降低程度没有老鼠神经元大（图5c），可能是由于iPSC分化神经元的病毒感染效率较低（iPSC为~35%，而老鼠神经元>95%，通过IRES-GFP判断；数据未显示）。和最近的研究结果一致的是，我们观察到我们的iPSC分化神经元在培养基中从脑部提取的嗜神经组织因子（neurotropicfactor,BDNF）被移除后升高了caspase3和/或7的活性（图6d、e）。通过HTTsiRNA转染实现的HTT敲除将caspase活性降低到接近野生型水平（图6d、e），说明存在一种mHTT依赖的神经毒性。在Q70的iPSC分化神经元中，NUB1过表达降低了caspase3和/或7的活性，表现出神经保护性（图6d、e）。总而言之，NUB1降低了mHTT含量，保护了我们测试的所有人类神经元模型中保护了神经元，这其中包括来自亨廷顿舞蹈症患者的iPSC分化神经元（最接近患者神经元的体外模型）。NUB1通过CUL3依赖的多聚泛素化降低mHTT含量mHTT赖氨酸残基的参与（图6a、b）和关于NUB1的研究报道表明了可能存在一种赖氨酸翻译后修饰机制，通过泛素样蛋白NEDD8或FAT10实现NUB1依赖的mHTT清除。评估NEDD8或FAT10对于底物的影响是具有挑战性的，这可能是通道过多或蛋白量过高的结果。因此，为了弄清NUB1对mHTT含量的改变是否需要NEDD8和／或FAT10参与，我们使用了老鼠HN10成神经细胞瘤细胞（表达了NEDD8但没有可测量的FAT10，补充图7）。当与一个HTT外显子1-Q73结构体共转染时，NUB1转染与空白转染相比显著降低了mHTT含量（补充图8a），表明NUB1依赖的mHTT降解并不需要FAT10。siRNA敲除NEDD8则阻碍了NUB1介导的HTT外显子1清除（补充图8a）。NUB1过表达对HTT外显子1-Q73_3R没有作用（补充图8a）。因此，NEDD8（而不是FAT10）是NUB1介导的mHTT降解所必须的。与mHTT清除需要NEDD8一样，对Q68成纤维细胞用MLN4924（一种强有力的NEDD8激活酶抑制剂）进行处理也能增加内源性mHTT含量（补充图8b左）。通过siRNA敲除实现的NUB1表达缺失导致了MLN4924活性缺失，表明其活性通路与功能性NUB1以及NEDD化级联反应有关（补充图8b右）。综上所述，最简单的解释就是mHTT受到NEDD8的调控（NEDD化），而NEDD化的mHTT通过NUB1被清除。然而，尽管我们付出了广泛的努力（数据未显示），我们依然没能检测到任何NEDD化的mHTT。因此，我们猜测是通道内的其他成分被NEDD化了而非mHTT本身。描述最完善的NEDD8底物是滞蛋白泛素E3连接酶类。我们通过过表达带有一个V5抗原决定基的显性负滞蛋白类（dnCUL1-dnCUL5）（见在线实验步骤）研究滞蛋白类对之前描述的过程的参与情况。只有dnCUL3过表达阻碍了NUB1介导的mHTT降解（从61.0±4.4%降为19.7±13.4%，n=5），表明CUL3参与了这一过程。因为CUL3是一个泛素E3连接酶的主要组成部分，我们便寻找mHTT的泛素化。我们在STHdh细胞中短暂地共表达了血凝素（HA）标记的HTT外显子1-Q73（Q73-HA）蛋白与NUB1/dnCUL3（任一或者两者均有，图7b）。细胞之后经过了MG132处理，Q73-HA经过免疫沉降反应后进行了westernblot（抗体结合泛素）以检测泛素化（图7b左）。我们在HTT外显子1-Q73中检测到了一个微弱的基线多聚泛素化信号，大约在110-160kDa处。NUB1过表达增强了该信号，并且与背景相比没有出现在赖氨酸三联突变体中。dnCUL3稍微降低了基线多聚泛素化，但强烈抑制了NUB1诱导的mHTT多聚泛素化增强。因此，似乎是NUB1过表达通过CUL3泛素E3连接酶增强了mHTT多聚泛素化过程。与依赖CUL3一致的是，dnCUL3共转染部分抑制了NUB1介导的STHdh细胞保护作用（图7）。这可以通过移除血清培养基后STHdhQ111/Q111细胞的caspase3和/或7酶活性降低程度进行测定（本实验中活性从36.5±0.6%降到25.1±0.1%）。这一结果进一步证实了CUL3的参与，并确认了NUB1介导的细胞保护是通过减少mHTT完成的。综上所述，NUB1促进HTT降解的一个可能的解释是，通过与HTT和NEDD化蛋白的实质性接触，NUB1将NEDD化的活性CUL3运送到HTT蛋白，增强了泛素化和HTT降解（补充图9）。IFNβ处理导致NUB1介导的mHTT含量降低为了加强NUB1介导的HTT降解，我们检测了作为一种潜在的亨廷顿舞蹈症治疗途径的NUB1表达诱导。根据前人报道，NUB1是一种可由IFNβ诱导的蛋白，而IFNβ经FDA批准可用于临床使用。因此，我们研究了IFNβ处理对HTT含量和神经毒性的影响，作为针对NUB1的可能治疗途径概念的证据。胞外使用IFNβ两天后在Q68成纤维细胞和STHdhQ7/Q111细胞中均出现NUB1蛋白含量升高和HTT含量降低的现象（图8）。这一影响不是通过改变HTT基因表达实现的，因为IFNβ处理没有减少HTT基因的mRNA含量（图8b）。HTT含量降低与IFNβ处理之间的剂量－应答关系具有617Uml-1的半最大效应浓度（EC50）（图8c），这与之前报道的诱导NUB1基因表达的IFNβ浓度接近；此外，IFNβ处理没有引起显著的毒性（图8c）。为了确认IFNβ诱导的HTT含量降低是由NUB1主导的，我们将NUB1基因的siRNA或者对照组siRNA转染入Q68成纤维细胞，之后对细胞进行IFNβ处理。与对照组或未转染的细胞相比，转染了NUB1基因siRNA的细胞的IFNβ剂量－应答曲线出现了明显的右移（EC50移至大于4000Uml-1；图8c）。为了探究在哺乳动物神经元中IFNβ是否能抑制mHTT诱导的毒性，我们对HTT140Q/140/Q初级神经元的培养体系进行了IFNβ处理以诱导NUB1蛋白的表达。HTT含量显著降低（wtHTT降低了36.9±10.6%而mHTT降低了50.0±7.7%；图8d）。HTT140Q/140/Q神经元的通透性恢复到了与经BDNF处理过的细胞相似的水平（102.6±3.0%；图8e）。与BDNF的无特异性神经营养功能相比，通过IFNβ的神经恢复只针对mHTT神经元，在野生型神经元中没有活性。这与之前的假说（即因IFNβ而增加的NUB1拯救了mHTT引发的神经毒性，而不是提供无特异性的神经保护）一致。为了进一步证明IFNβ通过NUB1保护神经元，我们检测了没有NUB1表达的IFNβ的影响。由于没有Nub1敲除的老鼠模型，我们在STHdh细胞中进行实验，而且通过siRNA达到了近乎完全的Nub1基因敲除（补充图4b）。在STHdhQ111/Q111细胞中，IFNβ抑制了刺激诱导的caspase活性（52.1±0.6%；图8f），而Nub1siRNA转染显著地削弱了这一影响（降至11.0±1.5%；图8f）表明IFNβ引发的保护作用的主要机制是通过NUB1完成的。上述发现突出了IFNβ或NUB1诱导作为亨廷顿舞蹈症治疗途径的潜能。讨论人们认为，减少mHTT的含量是一种有效的亨廷顿舞蹈症治疗方法。然而，由于没有针对mHTT含量变化的筛选方面的努力，经确认的调控mHTT蛋白的位点很少。这里我们报告了据我们所知的首次目标为确认mHTT含量调控物的全基因组筛选。尽管我们可能因各种失误（其中包括从果蝇到人类的同源基因绘谱不完全，以及其他在确认过程中不可避免的损失）排除了一些位点，我们通过在不同物种间测试和多个体系中实验将假阳性的风险降到最低。我们在人类患者细胞系中确认了13个调控内源性mHTT含量的位点，而测试的10个位点中的6个显示出与其在HTT蛋白实验中的活性一致的体内活性。尽管有报告显示在几百个确认的蛋白中NUB1与HTT存在相互作用，我们的研究是第一个展示NUB1在亨廷顿舞蹈症中的生物功能的。在人类神经元模型中，它减少了全长mHTT蛋白，防止了mHTT聚合物的形成。该活性在果蝇、人类和老鼠中均一致，证明了NUB1是一个强有力的，而且进化上保守的mHTT蛋白调控因子。在哺乳动物模型和转基因果蝇体内模型中，NUB1显示出mHTT特异性的神经保护活性。NUB1调控mHTT含量的功能及与之伴随的对依赖mHTT的细胞毒性的抑制一起，支持了定位NUB1基因的可能治疗策略。NUB1过表达可能也会降低wtHTT含量，至少在一些经实验的细胞系中（例如图5a）。这可能引发对靶向定位NUB1基因的关注；然而，与降低mHTT伴随的wtHTT部分缺失可能是对mHTT残留有利