感染性疾病的微生物学诊疗专家讲座

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感染性疾病临床微生物学诊疗

Clinicalmicrobiologydiagnosisof

infectiousdiseases

检验科王艳-9-12感染性疾病的微生物学诊疗第1页2了解临床微生物学在感染性疾病中的应用熟悉常用的临床微生物学检测技术熟悉抗菌药物敏感实验原理及准则掌握细菌耐药机制及常见耐药表型教学目标感染性疾病的微生物学诊疗第2页3一、临床微生物应用感染性疾病的微生物学诊疗第3页4Casestudy（1）女性，73岁，因手背部伤口不愈合来我院就诊；自述21天前被自家狗咬伤；外院门诊行清创术后5天，伤口内仍有脓性分泌物；初步诊疗：手背狗咬伤，手背感染；初步治疗方案：盐酸头孢替安+硫酸依替米星联合抗感染治疗。感染性疾病的微生物学诊疗第4页入院后行清创术，采集脓性分泌物进行培养第一次培养结果：

普通细菌培养：多杀巴斯德菌；

厌氧培养：未生长；

治疗前5感染性疾病的微生物学诊疗第5页6PasteurellamultocidaisaGram-negative,nonmotile(不动),coccobacillus(杆菌)belongingtothePasteurellaceaefamily.

Itcancauseavian(鸟类)cholera(霍乱)inbirdsandazoonotic(动物传染病 )infectioninhumans,whichtypicallyisaresultofbitesorscratchesfromdomesticpets.Manymammalsandfowl(家禽)harboritaspartoftheirnormalrespiratorymicrobiota,displayingasymptomatic(无症状)colonization.感染性疾病的微生物学诊疗第6页第二次培养结果：普通细菌培养：多杀巴斯德菌；厌氧培养：产黑普雷沃菌、梭杆菌梭杆菌

产黑普雷沃菌

Anaerobic，Gram-negativebacteria7感染性疾病的微生物学诊疗第7页8药敏试验：

多杀巴斯德菌:阿奇霉素S厌氧菌：甲硝唑S治疗：阿奇霉素+甲硝唑磷酸二钠治疗预后：经20余天治疗，患者病情平稳，皮肤向伤口内陷，无异常脓性分泌物。

治疗后感染性疾病的微生物学诊疗第8页9Question该病例应用了何种微生物检测技术？感染性疾病的微生物学诊疗第9页10Casestudy（2）男性，45岁，自诉8小时前自3米高处坠落，致左肘及左腕部肿痛畸形，左腕部开放流血；外院行左腕伤口清创缝合术；为深入治疗收入我院；初步诊疗：左尺、桡骨远端开放性骨折，左尺神经损伤。感染性疾病的微生物学诊疗第10页11入院第一天，患者左手部活动感觉较前减退，查房完全松开石膏绷带，左腕部缝合创口未见红肿及渗出，毛细血管充盈试验正常，入院后给予消肿药品和抗生素预防感染治疗。入院第二天和第三天，患者体温升高，最高达39℃，患部肿胀和入院时没有显著改变，继续对症观察治疗。入院第四天及以后，发觉左手腕部出现大小水泡，前臂远端及手指皮肤青紫，手部感觉减退，决定手术切开检验。术中穿刺水泡内容物，发觉液体黑暗、张力高、有恶臭味，涂片送检并取样进行细菌培养。感染性疾病的微生物学诊疗第11页分泌物涂片结果：见到革兰阳性粗大杆菌分泌物厌氧培养：产气荚膜梭菌

治疗前12感染性疾病的微生物学诊疗第12页13

产气荚膜梭菌

Clostridiumperfringens(formerlyknownasC.welchii)isaGram-positive,rod(杆)-shaped,anaerobic(厌氧),spore(孢子)-forming

bacteriumofthegenus(属)Clostridium.

C.perfringensgrowsreadily(轻易)onbloodagar(琼脂)plateinanaerobicconditionsandoftenproducesazoneofhemolysis(溶血环).

感染性疾病的微生物学诊疗第13页14C.perfringensisever(永远)presentinnatureandcanbefoundasanormalcomponentofdecaying(腐烂)vegetation,marinesediment(海洋沉积物),theintestinaltractofhumansandothervertebrates(脊椎动物),insects,andsoil(土壤).Clostridiumperfringensisthemostcommonbacterialagentforgasgangrene(坏疽),whichisnecrosis,putrefaction(腐烂)oftissues,andgasproduction.ItiscausedprimarilybyClostridiumperfringensalphatoxin.Thegasesformbubbles(气泡)inmuscle(crepitus捻发音)andthecharacteristicsmellindecomposing(腐烂)tissue.Afterrapidanddestructivelocalspread(whichcantakehours),systemicspreadofbacteriaandbacterialtoxinsmayresultindeath.Thisisaprobleminmajortraumaandinmilitarycontexts.感染性疾病的微生物学诊疗第14页15Question以上两个病例共同点，碰到类似患者应重视何种细菌培养？感染性疾病的微生物学诊疗第15页16深部外伤如车祸、挤压伤后，人或动物咬伤后继发感染，均可能合并厌氧菌感染。分泌物有恶臭，或为暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光，均可能是厌氧菌感染。感染组织局部产生大量气体：一些厌氧菌可产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发音，通常是产气荚膜梭菌感染特征。感染性疾病的微生物学诊疗第16页17Casestudy（3）女性，3岁，因左髋活动受限，疼痛4天，发烧4天入院；检验：最高到T39℃；WBC:13.64×109/L，N:86.8%；CRP和ESR均升高既往史：1年前于外院行左腹股沟囊肿切除术；诊疗：髋关节急性化脓性关节炎（左）；治疗：1、行左髋关节穿刺术，脓液培养2、头孢曲松（罗氏芬）抗感染治疗感染性疾病的微生物学诊疗第17页18穿刺液培养：沙门菌属（Salmonella）感染性疾病的微生物学诊疗第18页19药敏：亚胺培南（泰能）：S感染性疾病的微生物学诊疗第19页20Question从该病例中你得到了什么启示？感染性疾病的微生物学诊疗第20页21Casestudy（4）

女性，73岁，年6月8日入院；诊疗：腰椎术后20天，伤口感染；入院后连续发烧，最高到T：39℃；检验：胸片：双肺胸腔积液；

WBC:13.64×109/L，N:86.8%；CRP:123mg/L(正常值<8mg/L)；ESR:46mm；PCT:0.72ng/mL(正常值<0.1ng/mL)；G试验：

77.5pg/mL(正常值<10pg/mL)；治疗：万古霉素+头孢哌酮/舒巴坦抗感染,治疗效果不佳感染性疾病的微生物学诊疗第21页痰涂片：上皮细胞<10/LPF；WBC>25/LPF；G-杆菌（+）；类酵母菌（＋），假菌丝(+)22感染性疾病的微生物学诊疗第22页23

痰培养：白色念珠菌光滑念珠菌铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌尿培养：白色念珠菌便培养：白色念珠菌、光滑念珠菌分泌物培养：屎肠球菌血培养：荧光假单胞菌感染性疾病的微生物学诊疗第23页24Question从该病例中你得到了什么启示？感染性疾病的微生物学诊疗第24页25有念珠菌感染危险原因：恶性肿瘤长久卧床、营养差插尿管广谱抗生素抗真菌治疗感染性疾病的微生物学诊疗第25页26二、惯用临床微生物检测技术

感染性疾病的微生物学诊疗第26页27细菌染色

革兰染色；抗酸染色；墨汁染色细菌培养+判定+药敏普通培养；厌氧培养真菌培养+判定+药敏血清学试验

感染性疾病的微生物学诊疗第27页28

临床常见微生物标本培养血标本培养呼吸道标本培养尿及生殖道标本培养粪便标本培养脓液及分泌物标本培养无菌体液标本培养（脑脊液、关节液、胸腹水等）厌氧标本培养感染性疾病的微生物学诊疗第28页29血液感染是一个危重全身感染，对其进行病原菌检验，提供病原学诊疗极为主要。血培养是诊疗菌血症基本而主要方法，若从患者血液中检出细菌，普通视为感染，提醒有菌血症。继发性感染

血培养

BloodCulture感染性疾病的微生物学诊疗第29页30“只有在发烧时，才需要进行血培养。”血培养指征想采就采？感染性疾病的微生物学诊疗第30页31怀疑血流感染或脓毒血症时，应常规做血培养

血流感染症状及指征包含低血压或高血压WBC/CRP/PCT升高严重局部感染心率、呼吸频率异常加紧不明原因发烧或体温过低休克、寒战，僵直感染性疾病的微生物学诊疗第31页32“何时采血进行血培养，无特殊时间要求。”采血时机？感染性疾病的微生物学诊疗第32页33Time(min)体温03060菌血症水平Chills寒战BloodCultures血培养感染性疾病的微生物学诊疗第33页34

“为减轻患者痛苦，只采一份血液标本即可。”采血套数？感染性疾病的微生物学诊疗第34页35血培养套数与阳性检出率（％）65％80％96％99％感染性疾病的微生物学诊疗第35页36“每瓶采集多少血液无特殊要求。”采血量？感染性疾病的微生物学诊疗第36页37造成血流感染G-菌、G+菌、厌氧菌及真菌，其血培养阳性率均与采血体积相关阳性率标准体积：采血量为8-10ml,平均8.7ml;低体积：采血量<3.5ml;平均2.7mlMermelLA,etal.AnnInternMed.1993;119:270-272.感染性疾病的微生物学诊疗第37页导管相关血流感染（CRBSI）Catheterrelatedbloodstreaminfection中心静脉导管:通常选择锁骨下静脉、颈内静脉和股静脉。经外周静脉置入中心静脉导管（PICC）：通常选择肘部贵要静脉、正中静脉和头静脉。38感染性疾病的微生物学诊疗第38页

试验室（保留导管）导管外周静脉条件结果判断++CRBSI++导管较外周报阳时间快120分钟CRBSI导管细菌浓度较外周高5倍-+培养为金葡菌或念珠菌属，并缺乏其它感染证据则提醒可能为CRBSI+-导管定植菌或污染菌--非CRBSI普通情况取两份血，一套来自外周静脉，另一套来自导管内，两份血源采血时间应靠近且同时送检。39感染性疾病的微生物学诊疗第39页

试验室（不保留导管）导管尖端外周静脉I外周静脉II结果判断+++/-CRBSI-++/-培养为金葡菌或念珠菌属，并缺乏其它感染证据则提醒可能为CRBSI+--导管定植菌或污染菌---非CRBSI从独立外周静脉采两套血，同时在无菌状态下取出导管，剪下导管尖端5cm或近心端，一并送细菌室培养。40感染性疾病的微生物学诊疗第40页41下呼吸道感染是最常见呼吸道感染症，主要指肺实质性炎症肺炎和支气管黏膜炎症支气管炎，是我国常见病和病死率高感染性疾病。痰标本细菌学检验对呼吸道感染诊疗有主要意义。支气管肺泡灌洗液（PBAL)支气管毛刷

呼吸道标本培养

RespiratoryCulture

感染性疾病的微生物学诊疗第41页42送检指征下呼吸道感染患者可有发烧、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸痛、气急甚至呼吸困难，肺部可闻及湿啰音。白细胞总数和中性粒细胞百分比显著增高。X线检验肺部有炎症性浸润或胸腔积液等。感染性疾病的微生物学诊疗第42页43采集时间：痰：普通以晨痰为好采集方法：

自然咳痰法：清水重复漱口后，用力咳出呼吸道深部痰，将痰液直接吐入无菌容器中，标本量应≥2ml；无痰可用3％-5％NaCl5ml雾吸约5min导痰

标本采集感染性疾病的微生物学诊疗第43页44感染性疾病的微生物学诊疗第44页45尿路感染：指大量微生物在尿路中生长繁殖而引发尿路炎症。为最常见感染性疾病，发病率约占人口2%。多见于成年女性。尿路感染需要明确部位和急性与慢性，主要依病原菌检测。

尿培养

UrineCulture

感染性疾病的微生物学诊疗第45页46送检指征尿频、尿急、尿痛、排尿困难和耻骨上压痛肉眼脓尿或血尿尿常规检白细胞和（或）亚硝酸盐阳性留置导尿管患者出现发烧膀胱排空功效受损，有尿潴留感染性疾病的微生物学诊疗第46页47采集时间：晨起第一次尿液为佳采集方法：中段尿采集法：女性：成年女性外阴部先以肥皂水清洗，再以无菌水冲洗，然后排尿弃去前段尿，留取中段尿10ml左右于无菌试管内送检；男性：先用肥皂水清洗尿道口，后用清水冲洗，留取中段尿

标本采集感染性疾病的微生物学诊疗第47页48

注意事项：

◆无菌导尿管采集尿液，应在排出15ml尿液后搜集标本，但导尿轻易引发逆行性感染

◆留置导尿管采尿，应先以75%酒精消毒导管口，用无菌注射器搜集5-10ml尿，长久留置导尿管患者，应在更换新尿管时留取尿标本感染性疾病的微生物学诊疗第48页生殖道（Genitaltract)标本：（1）子宫内分泌物：采集时防止阴道和宫颈口正常菌群污染（2）盆腔脓肿：用无菌注射器从子宫直肠凹陷处抽取脓液（3）前列腺液：按摩前列腺采集标本或前列腺活检组织做细菌培养注：怀疑淋球菌感染，取材标本应注意保温并及时送检49感染性疾病的微生物学诊疗第49页50入院诊疗不是胃肠炎患者不做常规粪便培养。一次粪便培养阴性不能完全排除胃肠道病原菌存在。腹泻病人在发病早期（6h）内采集到血便或液状便效果最好。便培养主要针对感染性腹泻，如霍乱、沙门、志贺菌、副溶血弧菌等，住院3天以上发生抗生素相关性腹泻患者进行常规培养意义不大，可进行肠道菌群检测或难辨梭菌毒素检测。

粪便培养

StoolCulture感染性疾病的微生物学诊疗第50页51送检指征便涂片镜检白细胞≥5个/HP重症腹泻血便、脓液便未经抗生素治疗连续性腹泻感染性疾病的微生物学诊疗第51页52标本采集用药前自然排便，采集脓血、黏液部分2～3g。外观无异常粪便应从粪便表面不一样部位取材。液体便取絮状物1～2ml,置无菌容器内送检。如排便困难或婴幼儿患者，可用直肠拭子法采集标本。感染性疾病的微生物学诊疗第52页53感染性疾病的微生物学诊疗第53页54由创伤、手术、侵入性器械操作等外科治疗引发感染最为常见。细菌造成伤口感染普通认为需每克组织内细菌数量在105～106个以上。

脓液及分泌物培养

WoundandAbscessCulture感染性疾病的微生物学诊疗第54页55送检指征手术部位感染皮肤软组织感染和烧伤感染骨骼感染：骨髓炎、椎间盘感染感染性疾病的微生物学诊疗第55页56标本采集

开放性脓肿：无菌盐水或70%乙醇擦去表面渗出物，尽可能抽吸或将拭子深入伤口，用拭子深入溃疡基地部或边缘部，采集两个拭子分别做培养和革兰氏涂片染色。封闭性脓肿：消毒局部皮肤或粘膜表面后，用注射器抽取，将脓液注入无菌试管内送检。

感染性疾病的微生物学诊疗第56页57大面积烧伤创面分泌物：用无菌棉拭子取多部位创面脓液或分泌物，置无菌试管内送检。因为烧伤早期创面是无菌，经过12小时才可出现大量细菌，所以在烧伤后12小时内，勿采集创面标本，不然不能取得阳性结果。感染性疾病的微生物学诊疗第57页58厌氧菌分布十分广泛，是体内正常菌群组成组员，多为条件致病菌；厌氧菌感染遍布临床各科，且多为混合感染

厌氧培养

AnaerobicCulture感染性疾病的微生物学诊疗第58页59标本采集与运输标本采集与运输是否适当，对厌氧菌培养能否成功至关主要。采取标本时应尽可能防止接触空气，多使用针筒抽取，降低标本与空气接触机会。普通情况下，应从无正常菌群借居部位采取标本。感染性疾病的微生物学诊疗第59页60无菌体液培养

Sterilebodyfluidculture脑脊液、关节液、腹胸水、滑膜液、羊水、胆汁等培养标本。这些均由临床医生采样，采样后依据标本外观选择培养。显著炎性标本可直接注入无菌容器中送检，清或轻度混浊标本可按血培养方法操作。感染性疾病的微生物学诊疗第60页61三、抗菌药品敏感试验感染性疾病的微生物学诊疗第61页62抗菌药品敏感试验

测定抗菌药品在体外对病原微生物有没有抑菌或杀菌作用方法称为抗菌药品敏感性试验（AntimicrobialSusceptibilityTest），简称药敏试验（AST）。感染性疾病的微生物学诊疗第62页63药敏试验意义

预测抗菌治疗效果；指导抗菌药品临床应用；发觉或提醒细菌耐药机制存在，能帮助临床医生选择适当药品，防止产生或加重细菌耐药；监测细菌耐药性，分析耐药菌变迁，掌握耐药菌感染流行病学，以控制和预防耐药菌感染发生和流行。感染性疾病的微生物学诊疗第63页64药敏试验标准化CLSI：美国试验室标准化委员会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute)每年修订更改包含质控新药判定标准特殊耐药性检测感染性疾病的微生物学诊疗第64页65敏感性分类

敏感（Susceptible，S）用常规用量治疗有效常规用药时到达平均血药浓度超出细菌MIC5倍以上。耐药（Resistance,R）用常规用量治疗不能抑制细菌生长MIC高于药品在血、体液中可能到达浓度感染性疾病的微生物学诊疗第65页66中介(Intermediate,I)MIC靠近血、体液中药品浓度，治疗反应率低于敏感株药品生理浓集部位有效加大用药剂量可能有效缓冲区：预防操作系统误差造成结果重大判定错误剂量依赖敏感（Susceptible-dosedependent,SDD)高剂量使用该药依然安全时，高剂量给药可能有效感染性疾病的微生物学诊疗第66页67纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer，KB法），半定量药敏纸片抑菌环检测方法-1

感染性疾病的微生物学诊疗第67页68MIC法（minimalinhibitoryconcentration)稀释法(肉汤、琼脂)自动化仪器法抗生素连续梯度法(E-test)单位(ug/ml)检测方法-2

感染性疾病的微生物学诊疗第68页69肉汤稀释法：以一定浓度抗菌药品与含有被试菌株培养基进行一系列不一样倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度（MIC）。感染性疾病的微生物学诊疗第69页70

自动化仪器检测

美国BD企业phoenix100生物梅里埃企业VITEKAMS60感染性疾病的微生物学诊疗第70页71Etest法感染性疾病的微生物学诊疗第71页72四、细菌耐药感染性疾病的微生物学诊疗第72页73感染性疾病的微生物学诊疗第73页74感染性疾病的微生物学诊疗第74页75多重耐药菌株全球广泛流行

Gram-negativeEnterobacteriaceae(肠杆菌科)withresistancetocarbapenem(青霉烯)conferredbyNewDelhimetallo-β-lactamase1(NDM-1新德里金属β-内酰胺酶1)arepotentiallyamajorglobalhealthproblem.superbug感染性疾病的微生物学诊疗第75页76细菌耐药原因-“成也萧何败也萧何”

抗生素筛选和诱导作用耐药菌传输速度增加农业、渔业和家禽养殖业中抗生素添加感染性疾病的微生物学诊疗第76页77耐药菌株被快速选择和扩散个别细菌耐药xx耐药菌为主抗生素暴露

xxxxxxxxxx感染性疾病的微生物学诊疗第77页78固有耐药性(intrinsicresistance)指细菌对某种抗菌药品天然耐药性。起源于该细菌本身染色体上耐药基因,代代相传,含有经典种属特征。如，肠道杆菌对青霉素，铜绿假单胞菌对氨苄西林以及链球菌属对氨基糖苷类药品都属于固有耐药性。细菌耐药性

感染性疾病的微生物学诊疗第78页79取得耐药性(acquiredresistance)

是指细菌DNA改变造成其取得耐药性表型。原先对药品敏感细菌群体出现了反抗菌药品耐药性多由质粒介导耐药性。方式：transformation(转化)、transduction(转导)、

conjugation(接合)、transposition(转座)感染性疾病的微生物学诊疗第79页图细菌耐药机制示意图80感染性疾病的微生物学诊疗第80页81

常见耐药表型及耐药菌

β-内酰胺酶(β-lactamases)超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases)耐甲氧西林葡萄球菌（methecillinresistancestaphylococcus，MRS）氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌(high-levelaminoglycosideresistancestrainstoenterococcus)耐青霉素肺炎链球菌(penicillinresistanceS.pneumoniae,PRSP）感染性疾病的微生物学诊疗第81页82

常见耐药表型

β-内酰胺酶(β-lactamases)：细菌产生β-内酰胺酶能水解β-内酰胺类抗生素β-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性。临床意义：β-内酰胺酶阳性表面被检测菌株对青霉素、氨苄西林、阿莫西林等耐药，临床用这些药品治疗无效。感染性疾病的微生物学诊疗第82页83

常见耐药表型

超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)：是一个水解青霉素、头孢菌素及单环类抗菌药品酶。主要有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌。临床意义：检出产ESBLs菌株对全部青霉素类、头孢菌素及单环类抗菌药品耐药，临床治疗无效。感染性疾病的微生物学诊疗第83页84常见耐药菌

耐甲氧西林葡萄球菌（methecillinresistancestaphylococcus