抗肿瘤药物实验法

抗肿瘤药物实验法抗肿瘤药物实验法第1页在抗肿瘤研究中，大家提出了肿瘤多步骤、DNA突变、细胞凋亡、细胞周期关键机制、细胞周期开启及多条信号转导路径参加等许多理论和学说。

抗肿瘤药研究伴随理论更新和技术进步，已从以核酸等为靶点杀伤型细胞毒药转向对肿瘤新靶点研究。包含化学预防药、分化诱导剂、凋亡诱导剂、信号传导阻滞剂、血管生成抑制剂、肿瘤耐药逆转剂、生物调整剂以及化放疗保护剂等。

伴随新型抗癌药研究，诞生了许多抗肿瘤药品试验方法。抗肿瘤药物实验法第2页第1节肿瘤细胞体外筛选方法

一、抗肿瘤药体外方法

动物模型在抗肿瘤药品评价中起主要作用，但动物模型费用高，周期长使其不适合大规模抗肿瘤药品评价。所以抗肿瘤药初步筛选首先应采取肿瘤细胞体外试验方法，既节约成本又节约时间。抗肿瘤药物实验法第3页1.MTT法【基础原理】活细胞线粒体中存在脱氢酶能够代谢还原黄色溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑（MTT）为蓝紫色甲臜；而死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解甲臜后，570nm处酶标仪测定其吸光度（OD值）。OD值与活细胞数成正比，所以可依据OD值推测出活细胞数目，了解药品抑制或杀伤肿瘤细胞能力。抗肿瘤药物实验法第4页【操作步骤】（1）0.25%胰酶消化对数生长久细胞，5%～10%NBSRPMI1640调细胞浓度50000个/ml。96孔板100ul/孔。设溶剂对照，每组3-6平行孔。37℃，5%CO2、95%空气培养箱中预培养24h，弃上清。（2）加药品5个10倍稀释浓度（溶剂常见有二甲亚砜和水)，通常为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。（3）细胞连续培养24～72h，每孔加入10μl5mg/mlMTT溶液（以无血清培养基配制），继续培养4h。（4）吸去上清。加入200μlDMSO，轻轻振荡以使甲臜完全溶解。570nm处用酶标仪测定OD值。（5）计算抑制率(%)=（对照OD-药品OD）/对照OD*100%抗肿瘤药物实验法第5页2.XTT法【基础原理】XTT是MTT衍生物，经过活细胞代谢还原成水溶性代谢产物，代谢产物量与活细胞数目成正比，所以利用酶标仪在检测波长465nm处测定代谢物OD值能够推测活细胞数量。数据处理方法同MTT法。抗肿瘤药物实验法第6页【操作步骤】（1）细胞接种，药品处理均同MTT方法。（2）药品处理24～72h后，每孔加50μlXTT溶液（内含50μgXTT，5μl10mmol/L电子偶联剂(PMS)）继续培养4h。（3）96孔培养板振荡2～3min后，直接用酶标仪在465nm波优点测OD值。抗肿瘤药物实验法第7页【注意事项】（1）优点：XTT代谢产物溶解于水，不需要吸去上清就可测OD值，简单方便，降低误差。（2）XTT不易被线粒体酶还原，所以同时加入电子偶联剂(PMS)。（3）每孔XTT量不宜加入太多，高浓度代谢产物抑制线粒体酶活性。（4）XTT和PMS现用现配。抗肿瘤药物实验法第8页3.染料排斥法检测药品对肿瘤细胞生长抑制【基础原理】活细胞有排斥染料（如伊红、台盼蓝、苯胺黑等染色能力，而细胞死亡后因为膜完整性遭到破坏，细胞即被着色。抗肿瘤药物实验法第9页【操作步骤】（1）25ml培养瓶中加入细胞4×104个、受试药40μl，终体积4ml，（2）5%CO2，37℃培养48～96h。（3）取细胞悬液0.4ml，加0.4%台盼蓝液0.1ml，在室温作用5min，在15min内，细胞计数板计数约200个细胞中死细胞（蓝色）个数。【结果评定】（1）活细胞率%=（未染色细胞数/细胞总数）×100%。（2）将活细胞率与药品浓度对数作图，可得到S形剂量反应曲线，计算半数杀伤浓度（LC50）。（3）当LC50<10μg/ml并能重复时，提醒药品应深入试验。抗肿瘤药物实验法第10页【注意事项】

药品杀伤细胞作用可能被低估原因：

（1）存活细胞可能继续繁殖，使活细胞率增高。（2）死细胞可能过早地崩解，计数时已不存在，使死细胞率下降。抗肿瘤药物实验法第11页4.集落形成法测定药品对肿瘤克隆原细胞生长抑制作用【基础原理】克隆原细胞指含有连续增殖能力细胞。当单个细胞能连续分裂6代或以上时，其后代所组成群体（集落）含50个以上细胞。计数集落能够对克隆原细胞作定量分析。反应了单个细胞增殖潜力，能较灵敏地测定抗肿瘤药品活性，当前被认为是一个较理想检测方法。常见集落形成方法可分为贴壁法及半固体培养基法。抗肿瘤药物实验法第12页【操作步骤】（1）贴壁集落形成：适合用于几乎全部贴壁生长细胞。1）生长久贴壁细胞一瓶，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，活细胞计数，培养基稀释成50～100个细胞/ml。2）取直径33～35mm培养皿（或15ml培养瓶）或6孔板，每组3复孔/皿，受试药20μl，稀释后细胞悬液2ml，摇匀，5%CO2、37℃培养箱培养7～14天。3）弃上清，PBS洗2次，2ml/次，无水甲醇固定5min，静置干燥，用吉姆萨染色或1%结晶紫染色5～10min后，用自来水冲洗，室温干燥，镜下计数75μm以上集落。抗肿瘤药物实验法第13页（2）软琼脂集落形成：适用悬浮和贴壁生长细胞。

1）计数对数生长久细胞，15%NBS培养液配成1000个/ml细胞悬液，37℃温育。2）取33～35mm培养皿，3复皿，加受试药20μl。3）取37℃新鲜培养液9份，加沸水浴中融化5%琼脂液1份，摇匀，加入平皿，每个1ml，混匀置室温使琼脂凝固。4）取预温细胞悬液按每9.4ml加5%琼脂液0.6ml百分比混匀，加入已铺底层琼脂平皿中，每个1ml，置室温使琼脂凝固。5）将平皿置5%CO2，37℃孵育箱中培养7～10天。6）镜下计数直径大于75μm（50个细胞以上）集落。抗肿瘤药物实验法第14页【结果评定】（1）剂量反应曲线：以集落抑制百分率与剂量对数作图，能够得到一条S形曲线并求出药品半数抑制浓度（IC50）。

（2）亦可计算各加药组集落形成率。抗肿瘤药物实验法第15页5、癌细胞分化诱导试验

【基础原理】癌症属于细胞分化异常疾病。恶性肿瘤存在着显著细胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤等可在体外被一些化合物诱导分化为正常细胞或近似正常细胞。这些发觉为抗肿瘤药品研究开辟了一条新路径。所以，癌分化治疗已成为癌症研究主要前沿方向之一。抗肿瘤药物实验法第16页分化指标包含形态学改变、及生化功效改变。人早幼粒细胞白血病HL-60细胞分化诱导试验HL-60细胞分化为成熟度不一样粒细胞或巨噬细胞

硝基四氮唑蓝（NBT）试验:NBT还原能力应大于50％。

形态学改变观察:成熟粒细胞所占百分比越高，说明分化效果越好。

吞噬功效测定:分化诱导剂吞噬百分率应在50％以上。

抗肿瘤药物实验法第17页肝癌Bel7402细胞分化诱导试验【基础原理】肝癌Bel7402细胞甲胎蛋白（AFP）在肝癌中分泌量很高。γ-GT（半乳糖转移酶）在癌症发生发展过程中活性逐步上升。白蛋白（ALB）及TAT（酪氨酸转氨酶）在分化良好细胞下降。在体外测定这些蛋白含量及活性，用以判断肝癌细胞分化程度。

AFP及ALB测定：AFP、ALB放免测定试剂盒说明测定AFP及ALB含量

γ-GT、TAT测定：紫外可见分光光度法。抗肿瘤药物实验法第18页第2节肿瘤动物模型体内筛选方法

1.诱发肿瘤动物模型试验法2.自发肿瘤动物模型试验法3.移植性肿瘤动物模型试验法4.转基因动物肿瘤试验法抗肿瘤药物实验法第19页对诱发肿瘤评价诱发性肿瘤病因与由环境原因所诱致人癌情况相同。癌细胞增殖动力学在二者间亦靠近，故动物诱发肿瘤类似人体肿瘤。但人癌原因十分复杂，诱癌剂不清，肿瘤病理组织学与动物不一样，发生发展与动物诱发肿瘤不完全一致。诱发肿瘤不但诱发需时较长，成癌率不高。多数内脏肿瘤不作解剖，难以判断是否已发生肿瘤。发生时间先后、发展速度个体差异大。加之化学致癌物起源比较困难，并伴随环境保护意识增强对相关动物试验室提出了更高要求和限止，所以本法不宜作普通抗癌药品筛选应用.对移植性肿瘤有效药品，可用本法深入验证其抗癌疗效。抗肿瘤药物实验法第20页对自发肿瘤总评价其肿瘤发生率与瘤细胞动力学特点与人癌近似，生长较移植肿瘤慢，对药品敏感度不高，疗程较长，故便于进行综合化疗研究；理论上用带有自发肿瘤模型筛选药品较理想。然而，动物自发肿瘤病因取决于遗传特征，与人癌病因区分较大。极难在限定时间内得到大量生长均匀带瘤动物，各动物肿瘤之间生长速度差异也较大，给评价带来困难。这类肿瘤常见于特殊目标试验或作为“二级筛选”模型。

抗肿瘤药物实验法第21页对转基因小鼠肿瘤模型评价该模型很好地再现了人类肿瘤发生发展完整改变，包含机体从正常演变为癌前病变进而发展为恶性肿瘤全过程，该模型也为相关基因与肿瘤关系在整体水平研究和基因药品研发提供了良好伎俩。但肿瘤发生受到一个或多个基因协同调控，与转基因小鼠肿瘤模型不一样；该模型一样存在试验周期长、肿瘤发生时间不齐、繁育能力较低以及成本较高等缺点。抗肿瘤药物实验法第22页移植性肿瘤试验法动物移植性肿瘤试验法是最通用抗肿瘤方法，比自发性、诱发性及转基因动物肿瘤轻易造模,成功率高（100％），且能同时取得大量生长相对均匀肿瘤。普通给药7-10天，第8-11天解剖动物。观察指标：普通情况，体重改变及死亡率，判断药品是否有显著抑制肿瘤生长作用，为抗癌药品临床疗效提供有意义依据。动物移植性肿瘤是任何体外试验不能代替。抗肿瘤药物实验法第23页一个药品未必对各种类型移植性肿瘤有效，选择某一瘤株供筛选都可能漏筛药品。动物肿瘤生物学特点与人类有较大差距，动物瘤株恶性程度高，生长快速，对药品敏感性比人类自发癌瘤高得多，所以，对动物肿瘤生长有抑制药品对人癌不一定有效。本法命中率低。抗肿瘤药物实验法第24页筛选药品时最好采取三种瘤株，即肉瘤、腹水型肿瘤和白血病株肿瘤。我国用肉瘤S180、艾氏癌腹水型EAC和L615白血病，当前L615往往以P388或L1210小鼠白血病株取代。我国对新药在第一轮筛选有效基础上，推荐人癌异种模型进行第二轮筛选，即人癌进行T细胞免疫缺点或免疫抑制裸鼠异种移植模型。抗肿瘤药物实验法第25页1.1动物选择

常见小鼠、大鼠和地鼠。每批试验用同一性别（但乳癌、卵巢癌、宫颈癌等必须用雌性）。1.2肿瘤移植(1)普通要求

无菌、低温（消毒不严、瘤块污染常是接种失败主要原因）

接种部位:

皮下接种(右前肢腋);肌肉接种(大腿肌肉部);腹水型接种(腹腔)。抗肿瘤药物实验法第26页(2)瘤块制备：取接种7-10天、生长旺盛且无溃破瘤源。消毒，切开皮肤、瘤生长良好（无坏死或液化），放入无菌平皿，剪成2-3mm3小块。平皿应置于冰上。无菌套管针抽吸或向套管针内塞进一小瘤块。普通应在30min内接种完成。(3)瘤细胞悬液制备：数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，生理盐水适量稀释成l：3或l：4瘤细胞悬液。抗肿瘤药物实验法第27页(4)腹水型肿瘤悬液制备1)抽取腹水：选择接种后7-10天瘤源动物，腹水应为乳白色浓稠液体(如黄色或有大量红细胞则弃去)。2)细胞计数：用白细胞计数法计瘤细胞总数。3)接种：腹水用无菌生理盐水或含葡萄糖平衡盐水(如Hanks液、Gey液等)稀释至适当浓度（1×107/ml

），ip每鼠0.2ml。(5)白细胞瘤株接种：腹水型白细胞瘤如P388及L1210接种同腹水型肿瘤接种法。抗肿瘤药物实验法第28页1.3移植性动物肿瘤质量判定(1)每年进行一次试验动物瘤株组织学检验。(2)接种前置37℃培养箱内以检验细菌，霉菌;在接种和传代过程中，必须严格无菌操作，预防感染。(3)肿瘤生长潜力检验1)实体瘤：若对照组中20％肿瘤<400mg或平均重量<1g；大鼠肿瘤平均重量小于2g，作废。2)腹水型肿瘤：对照组平均生存率应在要求范围内。抗肿瘤药物实验法第29页(4)死亡分析：动物体重减轻、显著感染等都会影响试验可靠性，必须追究原因（是否给药剂量过大等）。(5)阳性对照：通常选取对所选瘤株敏感已知抗肿瘤药作阳性对照。如S180、EAC皮下型可用环磷酰胺20～30mg／(kg·d)；L615可用5-Fu25mg/(kg·d)。在同类型化合物抗肿瘤试验时，最好使用同类型临床有效药品。抗肿瘤药物实验法第30页1.4待筛药品给药路径化学合成药、抗生素滤液及植物药提取物，通常见ip、sc或ig给药，其它路径有im、iv等。1.5剂量选择一日量可用l/3～1/5LD50剂量参考同类药品临床剂量参考同类药品动物剂量预试验,开始有动物死亡计量l/3～1/5为一日量抗肿瘤药物实验法第31页1.6动物分组随机小鼠体重相差不超出4g；每组小鼠平均体重相差不宜超出1g；每组大鼠平均体重相差不宜超出5g。抗肿瘤药物实验法第32页1.7疗效评价(1)实体瘤疗效评价在治疗期间给药组死亡超出20％，或平均体重(去瘤后)下降(本身对照)超出15％者，表示药品毒性反应，降低剂量重新试验。瘤重抑制率％=(1-T／C)×100％中草药抑制率大于30％，合成药大于40％，并经统计学处理有显著差异时，认为有苗头，继续重复，连续3次，疗效稳定，则评定此药有一定疗效。抗肿瘤药物实验法第33页(2)腹水型肿瘤疗效评价：逐日统计动物死亡情况。对照组通常2-3周内死完。如对照组动物7天内死亡≥20％；或20％存活4周以上，试验作废。治疗组观察时间普通为30天或60天(生存超出此时限者，仍按30天或60天计算)。分别统计对照组和治疗组平均生存时间，按以下公式计算生命延长率：

生命延长率％=(T／C—1)×100％非腹腔给药时生命延长率大于50％，或腹腔给药生命延长率大于75％，并经统计学处理有显著差异时，认为有苗头，需继续试验。连续3次，疗效稳定，则评定此药有一定疗效。抗肿瘤药物实验法第34页1.8瘤株选择当前临床上常见抗肿瘤药大多首先经动物移植性肿瘤筛选而发觉，从寻找新药角度看来，按照我国当前条件和情况，筛选细胞毒类药品时可选取肉瘤Sl80腹水型或实体型、艾氏癌腹水型(EAC)或实体型(ESC)、肝癌Hep腹水型(HAC)或实体型(H22)、Lewis肺癌LL、白血病L1210和P388、黑色素瘤B16、肉瘤S37、肠癌C38、C26及Walker癌肉瘤W256等。抗肿瘤药物实验法第35页从天然产物中寻找新抗肿瘤药品可选取S180实体型、ESC、LL、L1210和P388、B16、HepA或S、肠癌C26、C38、子宫颈癌U14、白血病L615以及W256等。企图用一个模型去筛选各种不一样类型新药，显然是不恰当，因为各种动物移植瘤反抗癌药品敏感性不一样。抗肿瘤药物实验法第36页1.9肿瘤低温保留冷冻保留液能够改变细胞或瘤块渗透性，降低细胞内水分，预防水分在细胞内产生大量冰晶，如含15％甘油或10％二甲基亚砜培养基。冻存时，慢冻（引发细胞损伤最小），损伤是因为在极少许未结冰水中保留了高浓度电解质引发，所以细胞从0～-20C间冷冻速度要迟缓，普通以每分钟降1C为宜。然后再将安瓿放置于干冰(固体CO2)或液氮中保留。普通可保留6个月左右。速融，冻存管快速放入38-40度水浴，RPMI1640液洗涤1-2次，接种。抗肿瘤药物实验法第37页1.10移植性肿瘤试验法举例l.l0.1小鼠腹水型L1210模型【基础原理】将小鼠白血病L1210瘤细胞悬液ip小鼠，给予不一样剂量抗癌活性药品，可延长荷瘤宿主生命。【操作步骤】(1)无菌取DBA/2小鼠约7dL1210腹水，生理盐水配制成瘤细胞悬液，细胞数为5×106/ml，ip小鼠0.2ml(L1210细胞105个)。每组6-10只动物。（雄性,l8-22g，雌性17-21g，每次试验均用同一性别），接种当日为d0。抗肿瘤药物实验法第38页

(2)

d1称重、随机分组，给药，包含阴性对照(溶剂)及阳性对照药，普通用腹腔注射(方案可有各种：仅给1次，次日给药；每日一次，连续7天；于第1、5天或第1、5、9天每隔4天给药一次等)。统计30天内各组动物死亡情况，至第30天，统计各组动物平均死亡率。【结果计算】依据公式计算试药对L1210延长生命率。(L1210平均存活期8-1ld。普通腹水型肿瘤试验观察期为30d，未死亡动物以30d计)。抗肿瘤药物实验法第39页【方法评价】(1)本法也适用P388、EAC、HepA、w256及S180等腹水型移植性肿瘤模型。(2)给药组第5天动物存活数应大于65％，不然表示药品剂量过大。(3)若阴性对照组动物在15d内仍不死亡，说明试验失败，应分析原因，重做。抗肿瘤药物实验法第40页1.10.2实体瘤模型以肉瘤S180皮下接种【基础原理】皮下接种同种宿主前肢腋下S180，给予抗癌活性药品，能够抑制肿瘤在体内生长。【操作步骤】(1)无菌取接种于昆明小鼠约7天S180腹水或S180肿瘤。

S180肿瘤无菌剔除包膜和坏死个别，选取完好瘤块，置于玻璃匀浆器内，加入适量生理盐水，计数，以生理盐水配制成悬液（1×107／ml），0.2ml/只接种于小鼠前肢腋下，10只一组（雄性体重l8-22g；雌性17-21g）。

抗肿瘤药物实验法第41页(2)第2天（d1）称重、分组、给药。(3)第11天，动物称体重，取肿瘤，称重，最计算抑瘤率。【结果计算】按上式计算样本对S180抑瘤率。【注意事项】(1)本法适合用于Hep、w256及C26等实体型模型。(2)标准上,阳性对照组肿瘤抑瘤率应>80％。阴性对照组肿瘤为2g左右。(3)试验组动物体重不低于原始体重20％，不然表示试药剂量过高，需降低剂量重试。抗肿瘤药物实验法第42页1.10.3肌肉接种大鼠Walker癌肉瘤W256模型【操作步骤】(1)Wistar大鼠，55-65g。后腿肌内接种瘤细胞悬液0.2ml(约2-4×106个瘤细胞),每组用6-10只动物.(2)接种分组给药同前。至第8-11天，处死动物，将双侧后肢从髓关节处剪下，分别称重，荷瘤肢重减去正常肢重即为瘤重。【结果计算】按荷瘤宿主瘤重抑制率公式计算。抗肿瘤药物实验法第43页[注意事项](1)本法也适合用于S180及EAC等肿瘤。(2)接种用瘤源有两种：一个取用腹水型瘤源，取传代6-8天瘤源，抽出腹水应带有血性；另一个取用皮下接种肿瘤以匀浆法制成瘤细胞悬液。(3)对照组肌肉型平均瘤重为3-5g；皮下型平均瘤重为3-12g；腹水型平均生存l0-14天。(4)d7给药动物存活率>65％,不然剂量过大。抗肿瘤药物实验法第44页1.10.4足趾皮下接种小鼠Lewis肺癌模型【基础原理】恶性程度较高，受体鼠为C57BL/6，SC、IM接种对药品敏感性较低，自发转移肺。接种于后足趾皮下后，待肿瘤生长10d，切除带瘤足趾称重，计算抑制率。【操作步骤】取皮下接种8-12d肿瘤，制成1×107/ml悬液,足趾皮下接种5×105/0.02ml，接种于C57BL/6,18-24g，6-7Wk。给药后，次日处死动物，将带瘤后足趾从足关节处剪下，分别称取荷瘤足趾重，与阴性对照组比较，计算抑瘤率。【结果计算】计算肿瘤抑制率.抗肿瘤药物实验法第45页【注意事项】(1)Lewis肺癌因为其接种部位不一样，可观察抑瘤率、生命延长率、自发肺转移。(2)Lewis肺癌对环磷酰胺及亚硝脲敏感，对5-Fu及博来霉素敏感性稍差。(3)Lewis肺癌足趾接种含有两种意义：一是直接取荷瘤足趾测算样本对原发灶抑瘤率；继续给药又可观察样本对自发肺转移效果。(4)本试验只适合用于宿主为近交系肿瘤模型，因接种细胞量偏少，若应用于非近交系动物，肿瘤生长将会出现较大偏差，结果难以统计。抗肿瘤药物实验法第46页1.10.5人体肿瘤异种移植于裸鼠模型【基础原理】裸鼠又称无胸腺小鼠，含有先天性胸腺缺失；胸腺依赖性免疫功效缺乏，其T细胞功效靠近于零，但B细胞功效基础正常，体内不具排斥反应，故是人体肿瘤异种移植理想宿主。异种移植于裸鼠体内人体肿瘤仍保持其原有组织形态及生化功效，以及特有染色体组型和反抗肿瘤药原有敏感性。普通认为人体肿瘤异种移植于裸鼠模型反抗癌药反应与临床有很好相关性，对临床疗效有主要参考价值。抗肿瘤药物实验法第47页【操作步骤】

(1)人体肿瘤异种移植于裸鼠瘤源：

一是已建株人体肿瘤异种移植于裸鼠模型，腹水型或实体型，与移植性动物肿瘤模型一样进行操作。

二是培养各种病理类型人体肿瘤细胞。

(2)经一定潜伏期，可见肿瘤生长。待肿瘤增殖至可触及时(瘤结节约400mg)，将动物随机分组，进行治疗。亦可在肿瘤接种后次日即分组治疗。抗肿瘤药物实验法第48页

【结果计算】(1)计算给药组肿瘤抑制率、生命延长率。其计算方法同移植性动物肿瘤模型。(2)裸鼠因皮肤无毛，可便于用卡尺从体外测量肿瘤体积，易于动态观察肿瘤生长状态，比较治疗组和对照组肿瘤增殖曲线改变。每次测量肿瘤长径(L)和短径(W)依据以下公式计算肿瘤体积(V)：V=(L×w2)/2。抗肿瘤药物实验法第49页【注意事项】(1)裸鼠因T细胞免疫缺点特征，故对外界环境非常敏感，所以裸鼠一定要喂养于无特殊病原体(SPF)环境，最少需喂养于层流架内，其喂养笼需附带有滤膜盖。所接触和使用器具、饲料、饮水、垫料、笼具均预先用高压灭菌处理过。所用试药也应无菌处理。试验操作也应在层流柜内进行。(2)价格比较昂贵，试验所需代价高。普通要在试药经过动物移植性肿瘤有效基础上再进行本试验试验。抗肿瘤药物实验法第50页(3)异种移植于裸鼠体内人体肿瘤因仍保持其原有肿瘤特征，故其生长周期相对较动物肿瘤模型为长，所以，相关给药方案，尤其是给药时间和周期因瘤株而异。抗肿瘤药物实验法第51页1.10.6小鼠肾囊膜下肿瘤移植法·1.10.7抗转移模型举例1.10.7.1Lewis肺癌自发肺转移模型1.10.7.2B16小鼠黑色素瘤人工肺转移模型1.10.7.3小鼠Hep肝癌脾内移植后肝转移模型1.10.8癌侵袭动物模型1.10.8.1癌骨侵袭大鼠walker-256模型1.10.8.2肾侵袭小鼠宫颈癌U14模型1.10.9原位移植癌动物模型1.10.9.1小鼠胶质母细胞瘤G422脑原位瘤试验法‘1.10.9.2大鼠肝癌BERH一2肝原位移植癌试验法1.10.9.3人胃癌SGC一7901裸鼠原位接种模型，1.10.10W256肝内接种介入治疗模型1.10.11癌分化诱导动物模型等。抗肿瘤药物实验法第52页抗肿瘤药物实验法第53页四、转基因动物肿瘤模型转基因动物肿瘤模型（Tumormodelsoftransgenicanimal）是指经过重组DNA技术将外源肿瘤基因或相关基因导入动物染色体基因组，使之稳定表示并能遗传给后代一类肿瘤动物模型。转基因方法主要有显微注射法、精子载体法、电转移、胚胎干细胞移植法、反转录病毒感染法、人工酵母染色法等各种方法。用转基因技术构建肿瘤模型可为肿瘤研究提供理想动物模型，为深入研究其发病机制以及基因药品等创造了前所未有条件，为人类准确地研究基因与疾病相关关系提供了可能。但转基因动物肿瘤模型也存在一定稳定性，长久繁育传代过程中会发生性状改变，甚至丢失。胚胎或精子冷冻保留技术应用可防止这种现象发生。并在发育和研究中加强对动物肿瘤生长生物学特征观察，同时利用PCR技术检测外源肿瘤基因在动物体内表示，以防外源肿瘤基因丢失。（一）乙型肝炎病毒（HBV）转基因动物肿瘤模型（二）乳腺癌转基因小鼠模型抗肿瘤药物实验法第54页

三、体外肿瘤细胞迁移、侵袭能力检测模型（一）细胞划痕试验（Woundhealingassay）【基础原理】上皮细胞，成纤维细胞，肿瘤细胞等，在生理状态下，常形成单层或者复层上皮细胞。在病理状态下，细胞迁移时候则以侧向运动为主。细胞划痕试验是将细胞单层培养在培养板上，待细胞融合后机械性地使小片细胞脱落，然后继续培养细胞，观察细胞向无细胞划痕区域迁移情况试验，很好模拟了这种侧向迁移运动，一直被用来检测细胞迁移能力。抗肿瘤药物实验法第55页【操作步骤】（1）

准备：全部能灭菌器械都要灭菌，直尺和Marker笔操作前要在超净台内紫外照射30min。（2）

用Marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔最少穿过5条线（3）

向孔中加入约106个细胞，因细胞增殖能力不一样而略有不一样，37℃,5%CO2孵育过夜，使细胞贴壁，铺满板底即可。（4）

第二天，用200μl枪头在细胞表面进行划痕，枪头应尽可能垂直于孔背后横线，可用直尺比着，枪头要垂直。（5）

用PBS洗涤细胞3次，去除划下细胞，然后加入低血清培养液（含1%～2%FBS），放入孵箱，37℃,5%CO2孵育。（6）

在0~24h内取不一样时间点拍照，经过计算划痕区域内无细胞区面积统计细胞迁移情况。【结果判定】比较各组划痕区域内细胞数目多少、计算划痕区域内无细胞区大小或面积。【注意事项与模型评价】划痕法优点：价格低廉，操作简单，细胞外围环境简单，轻易控制。划痕法不足：对细胞要求高，适用细胞系范围较窄。划痕试验要求细胞本身含有较强迁移能力，且对无血清培养环境有较强忍受力，所以只适合用于上皮、纤维样细胞系和个别肿瘤细胞系。抗肿瘤药物实验法第56页（二）Transwell（Boyden小室）试验Transwell准确说应该是一个试验技术，这项技术主要材料是Transwell小室或Boyden小室，是一类有通透性杯状装置，杯子底层一张有通透性膜，这层膜带有微孔，孔径大小有0.1～12.0µm，依据不一样需要可用不一样材料，普通常见是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane）。应用不一样孔径和经过不一样处理聚碳酸酯膜，就能够进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等各种方面研究。抗肿瘤药物实验法第57页1.Matrigel侵袭试验【基础原理】肿瘤侵袭基底膜被认为是转移发生过程中一个关键步骤。肿瘤细胞最初穿过基底膜是它们侵入淋巴系统或血管床开始，随即肿瘤细胞经过血行散播或淋巴转移进入靶器官/组织，最终形成转移灶。为了体外分析评定肿瘤细胞侵袭能力，大家研发了多个系统来评定细胞侵袭穿过基底膜能力。一些试验利用组织基底膜提取物，比如羊膜、鸡绒(毛)膜尿囊膜、晶状体囊膜和膀胱壁等。然而，因为组织本身异质性，这些基质试验重复性并不理想。而且，提取这些基质通常需要很长时间，技术上也很复杂。所以，大家研制出了同质性更加好细胞外基质来用于体外侵袭试验研究。其中应用最广泛就是Matrigel从一个富含细胞外基质蛋白小鼠Engelbreth–Holm–Swarm肉瘤中提取可溶性基底膜。它主要包含层黏连蛋白Ⅳ型胶原、硫酸类肝素蛋白多糖等各种基底膜组分。在试验室里，Matrigel加工应用起来相对简单。这个别侵袭试验检测是细胞黏附在基质胶上，侵袭进入和穿过基质，继而朝向趋化因子方向迁移能力。这些步骤被证实是肿瘤转移关键步骤。抗肿瘤药物实验法第58页【操作步骤】（1）Matrigel胶包被小室制备1）解冻未开封Matrigel溶液，置于冰上放入冰箱里，最少6h，推荐过夜解冻。遇冷全部细胞培养板、Transwell小室或Boyden小室、无菌吸量管、小管。除非有所提醒，不然全部步骤都应该在无菌条件下进行。2）摇动瓶子使Matrigel更加好溶解。吸收适量Matrigel稀释到所需要浓度。起始浓度可选择1.2mg/ml,0.6mg/ml,0.3mg/ml等，溶解于无血清培养基中。吸出5ml待用，剩下Matrigel应马上储存在–20℃。3）室温无菌环境下，小心吸收Matrigel溶液于小室膜上方，轻轻转动