免疫学检测技术的基本原理

免疫学检测技术的基本原理免疫学检测技术的基本原理第1页第一节基于抗原-抗体反应检测方法第二节免疫细胞检测第三节分子生物学技术在免疫学上应用本章内容免疫学检测技术的基本原理第2页第一节基于抗原-抗体反应检测方法一、抗原抗体反应概念抗原与对应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。在适当条件下所进行体外反应中，抗原与对应抗体特异性结合可展现某种反应现象（如凝集、沉淀）。因为试验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。免疫学检测技术的基本原理第3页二、抗原抗体反应特点高度特异性可准确区分物质间极微细差异。表示为亲和力：一个抗原表位与对应抗体单一抗原结合位点间结合能力。亲协力：指一个抗体分子与整个抗原大分子间结合强度，与抗原表位数目相关。免疫学检测技术的基本原理第4页2.抗原抗体结合带现象与可见性抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜抗原抗体浓度和百分比（等带）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见反应；免疫学检测技术的基本原理第5页3.表面化学基团之间可逆结合抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度影响而解离，解离后抗原抗体仍含有原有特征，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。抗原抗体反应2个阶段第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第2阶段是小抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。免疫学检测技术的基本原理第6页三、抗原抗体反应影响原因电解质抗原抗体等电点分别为pH3-5和pH5-6，在中性或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度电解质会使它们失去一个别负电荷而相互结合；温度通常为37℃，适当提升反应温度可增加抗原与抗体分子碰撞机会，但56℃以上可使抗原或抗体变性失活；酸碱度抗原抗体反应最适pH值在6-8之间，pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体理化性质。当pH值靠近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，因为本身吸引而出现凝集，造成非特异性反应。免疫学检测技术的基本原理第7页四、抗原抗体反应检测技术应用抗原与对应抗体在体内、外发生高度特异性结合反应。在适当条件下所进行体外反应中，抗原与对应抗体特异性结合可展现某种反应现象（如凝集、沉淀）。因为试验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。免疫学检测技术的基本原理第8页抗原抗体反应凝集反应直接凝集间接凝集沉淀反应免疫比浊单向免疫扩散双向免疫扩散免疫电泳蛋白芯片技术免疫标记荧光酶同位素化学发光胶体金免疫印迹五、抗原-抗体反应基础检测方法免疫学检测技术的基本原理第9页AbAg高亲和力AbAg低亲和力特异性结协力表示方法亲和力和亲协力低亲协力高亲协力Ag-Ab反应原理免疫学检测技术的基本原理第10页Ab过剩Ag过剩百分比适当，交联成网络Ag-Ab反应可见性免疫学检测技术的基本原理第11页1.凝集反应直接凝集反应1:2稀释待测血清1:41:81:16细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原颗粒状物质与对应Ab在电解质存在情况下直接反应，二者百分比适当时，出现肉眼可见凝集团现象。玻片法试管法常见于菌种判定或ABO血型判定选择最正确稀释浓度，常见于检测抗体滴度或效价，见于临床诊疗伤寒或副伤寒所用肥达氏反应和诊疗布氏菌病所用瑞特试验。免疫学检测技术的基本原理第12页间接凝集反应将可溶性Ag/Ab先吸附在一些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与对应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上类风湿因子检测。凝集反应常见于溶血性疾病诊疗：+YYYYYYYYYYYY病人RBC体内anti-Rh因为抗体多属于IgG，分子量较小，抗体与红细胞间结协力不能克服细胞间排斥力，不出现凝集+YYYYYYYYYYYYYYY体外加入抗人IgG出现凝集现象，叫直接库姆试验正常人O型血Rh+RBC+YYYY患者血清内游离anti-Rh+Y体外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出现凝集现象，叫间接库姆试验免疫学检测技术的基本原理第13页2.沉淀反应AgAgAgAgAbingel单向免疫扩散Ag1AbAg2Ag3Ag4双向免疫扩散免疫比浊过量AbAbAbAb毒素、组织浸液及血清中蛋白等可溶性抗原与对应抗体反应后，出现肉眼可见沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。判定各种抗原是完全相同、个别相同或完全不一样用于确定抗原浓度免疫学检测技术的基本原理第14页沉淀反应—免疫电泳存在于不一样区域抗原与抗体结合，在百分比适宜处形成沉淀弧。沉淀弧数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品成份及其性质。免疫学检测技术的基本原理第15页3.免疫标识技术免疫酶测定法免疫荧光技术放射免疫测定法免疫胶体金技术免疫学检测技术的基本原理第16页①免疫酶测定法夹心法ELISA间接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁微粒捕捉酶免疫分析技术将已知特异性抗体致敏免疫微粒与生物素、亲和素、酶相结合，最终酶作用于荧光底物发光，经过检测荧光强度判断未知抗原含量。a）b）免疫学检测技术的基本原理第17页免疫组化技术定位、定性、定量检测免疫学检测技术的基本原理第18页②免疫荧光技术免疫学检测技术的基本原理第19页③放射免疫测定用放射性核素标识抗原或抗体进行免疫测定。将同位素敏感性与抗原抗体结合特异性结合起来，含有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药品等微量物质检测。常见有131I、125I。④化学发光免疫技术将化学发光分析和免疫反应相结合而建立一个新免疫分析技术。最常见发光物质是鲁米诺。灵敏度高、简便、可实现自动化分析。免疫学检测技术的基本原理第20页⑤免疫胶体金技术用胶体金颗粒标识Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab方法。氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小金颗粒，形成带负电疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定胶体状态。该技术可应用于免疫组化(光镜下检验)和免疫层析快速诊疗。免疫学检测技术的基本原理第21页⑥免疫印迹法-Westernblotting免疫学检测技术的基本原理第22页4.蛋白质芯片技术又称为蛋白质微列阵，指固定于支持介质上大量蛋白质组成微列阵。依据蛋白质分子间特异性结合原理，可实现快速、准确、高通量检测。免疫学检测技术的基本原理第23页第二节免疫细胞检测淋巴细胞及其亚群分离免疫细胞功效测定磁珠分离法免疫吸附分离法流式细胞术肽—MHC四聚体技术T细胞功效测定B细胞功效测定细胞因子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试验吞噬功效测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法免疫学检测技术的基本原理第24页一、免疫细胞及其亚类计数稀释血液淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)离心单个核细胞(PBMC，包含淋巴细胞、DC和NK)红细胞和粒细胞血浆外周血单个核细胞分离免疫学检测技术的基本原理第25页外周血单个核细胞分离稀释血液淋巴细胞分离液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)离心单个核细胞(PBMC，包含淋巴细胞、DC和NK)红细胞和粒细胞血浆免疫学检测技术的基本原理第26页磁珠分离法免疫吸附分离法流式细胞术肽—MHC四聚体技术淋巴细胞及其亚群分离免疫学检测技术的基本原理第27页免疫吸附分离法加入淋巴细胞悬液anti-CD4anti-CD4anti-CD4弃上清免疫学检测技术的基本原理第28页磁珠分离法免疫学检测技术的基本原理第29页流式细胞术荧光抗体标识混合细胞喷嘴单细胞悬液5000-10000个/秒细胞分选器荧光检测器免疫学检测技术的基本原理第30页抗原肽-MHC四聚体分离技术亲和素抗原肽MHCI生物素anti-CD8肽-四聚体肽特异性CD8TCD4T及B非肽特异性CD8T荧光素免疫学检测技术的基本原理第31页二、免疫细胞功效测定T细胞功效测定B细胞功效测定细胞因子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试验吞噬功效测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法免疫学检测技术的基本原理第32页T细胞功效测定T细胞增殖试验迟发型超敏反应检测T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可经过以下三种方法检测：形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核涣散及出现较多核仁；3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成DNA中，用液体闪烁仪检测样品放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑盐)比色法：外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同抗原作皮试，可造成迟发型超敏反应，T细胞活化并释放各种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h抵达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常见于检测一些微生物感染。免疫学检测技术的基本原理第33页B细胞功效测定抗体含量测定溶血空斑试验可经过单项琼脂扩散法、ELISA、速率比浊法等测定标本中各类Ig含量。绵羊红细胞(SRBC)免疫动物4天后取出动物脾脏，在脾细胞悬液中含有抗SRBC浆细胞脾细胞与SRBC在适量琼脂糖液中混匀在抗体形成细胞周围出现溶解透明区，即溶血空斑。1个空斑区代表1个浆细胞经过统计溶血空斑数目可知抗原特异性B细胞数目加入新鲜补体，倒入平皿中培养免疫学检测技术的基本原理第34页细胞毒试验51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法靶细胞被杀伤后，向体系中加入台盼兰，可进入膜破损细胞内，将细胞染成蓝色。活细胞拒染而不着色。免疫学检测技术的基本原理第35页凋亡细胞检测法琼脂糖电泳法正常细胞基因组DNA凋亡细胞TUNEL法在细胞中加入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和生物素标识核苷酸TdT能在游离DNA3’端缺口连接标识核苷酸加入亲和素-酶复合物，在DNA断裂处显色流式细胞术AnnexinVPI凋亡早期凋亡晚期坏死期免疫学检测技术的基本原理第36页巨噬细胞吞噬试验吞噬功效测定硝基蓝四氮唑(NBT)试验NBT在杀菌过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞内NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中。光镜下计数NBT阳性细胞可反应PMN杀伤功效。将待测mf与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被mf吞噬，依据吞噬百分率确定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有红细胞mf/mf总数免疫学检测技术的基本原理第37页细胞因子检测生物活性检测法免疫学检测法夹心ELISA或ELISPOT荧光素标识抗体染胞内细胞因子，FACS分析细胞增殖或增殖抑制法，如细胞因子依赖性或抑制性细胞株细胞病变抑制法，如感干扰素抑制病毒感染性细胞损伤免疫学检测技术的基本原理第38页检测B细胞产生抗体检测T细胞产生CK酶联免疫斑点试验-ELISpot

免疫学检测技术的基本原理第39页对血细胞恶性变如白血病、淋巴瘤等诊疗，长久以来多应用细胞形态学检验和免疫细胞表型分析。因为这些方法在特异性和敏感性上限制，对于丢失了细胞表面标志，或分化很好难以和正常细胞区分。也可能因为恶性细胞数量少，混在大量正常细胞中难以查出。第三节分子生物学技术在免疫学上应用免疫学检测技术的基本原理第40页一、BCR和TCR基因重排检测

利用分子生物学，取得Ig片段特异基因克隆及TCR各链基因克隆，分别应用Ig基因和TCR基因重排作为B细胞和T细胞特异标识，分别诊疗B细胞起