基因工程专题知识讲座

基因工程专题知识讲座基因工程专题知识讲座第1页第一节

DNA重组

DNARecombination

基因工程专题知识讲座第2页DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用

(transduction)转座

(transposition)同源重组

(homologousrecombination)位点特异重组(site-specificrecombination)基因工程专题知识讲座第3页发生在同源序列间重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基础重组。是最基础DNA重组方式，经过链断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段交换。以E.coli同源重组为例，了解同源重组机制Holliday模型。一、同源重组基因工程专题知识讲座第4页Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA一条链断裂、并与另一个DNA对应链连接，形成Holliday中间体③经过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)基因工程专题知识讲座第5页片段重组体（见模型图左边产物）：切开链与原来断裂是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开链并非原来断裂链，重组体异源双链区两侧来自不一样亲本DNA。基因工程专题知识讲座第6页

内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录基因工程专题知识讲座第7页Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录基因工程专题知识讲座第8页二、细菌基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌经过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）DNA转移称为接合作用(conjugation)。基因工程专题知识讲座第9页可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒——细菌染色体外小型环状双链DNA分子基因工程专题知识讲座第10页（二）转化作用经过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养受体细胞取得新遗传表型，称为转化作用

(transformation)。

基因工程专题知识讲座第11页例：溶菌时，裂解DNA片段被另一细菌摄取。基因工程专题知识讲座第12页目录基因工程专题知识讲座第13页（三）转导作用当病毒从被感染（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。基因工程专题知识讲座第14页λ噬菌体生活史溶菌生长路径(lysispathway)溶源菌生长路径(lysogenicpathway)例目录基因工程专题知识讲座第15页目录基因工程专题知识讲座第16页三、位点特异重组位点特异重组(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在两个DNA序列特异位点间发生整合。例（一）λ噬菌体DNA整合λ噬菌体整合酶识别噬菌体和宿主染色体特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。

基因工程专题知识讲座第17页例（二）细菌特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变基因工程专题知识讲座第18页hix为反向重复序列，它们之间H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个开启子P，其一驱动hin基因表示，另一正向时驱动H2和rH1基因表示，反向(倒位)时H2和rH1不表示。rH1为H1阻遏蛋白基因。基因工程专题知识讲座第19页H2鞭毛素

阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA开启序列H1开启序列沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变基因工程专题知识讲座第20页例（三）免疫球蛋白基因重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。

轻链基因片段：重链基因片段：LVJCLVDJC基因工程专题知识讲座第21页重链(IgH)基因V-D-J重排和轻链(IgL)基因V-J重排均发生在特异位点上。在V片段下游，J片段上游以及D片段两侧均存在保守重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段基因工程专题知识讲座第22页V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程目录基因工程专题知识讲座第23页四、转座重组由插入序列和转座子介导基因移位或重排称为转座(transposition)。基因工程专题知识讲座第24页插入序列(insertionsequences,IS)组成：二个分离反向重复(invertedrepeats,IR)序列特有正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因

IRTransposaseGeneIR发生形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)（一）插入序列转座基因工程专题知识讲座第25页插入序列复制性转座目录基因工程专题知识讲座第26页转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点分散重复序列。

转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座基因工程专题知识讲座第27页基因工程专题知识讲座第28页由转座子介导转座目录基因工程专题知识讲座第29页第二节

重组DNA技术DNARecombinationTechnique基因工程专题知识讲座第30页重组DNA技术发展史年G.J.Mendel豌豆杂交试验1944年O.T.Avery肺炎球菌转化试验1973年美国斯坦福大学科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程企业，专门应用重组DNA技术制造医学上主要药品。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素工厂1997年英国罗林研究所成功克隆了多莉基因工程专题知识讲座第31页相关概念DNA克隆工具酶目标基因基因载体基础原理重组DNA技术与医学关系本节主要内容基因工程专题知识讲座第32页一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖相同副本或拷贝集合。获取同一拷贝过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆基因工程专题知识讲座第33页技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

细胞克隆个体克隆（动物或植物）基因工程专题知识讲座第34页DNA克隆应用酶学方法，在体外将各种起源遗传物质（同源或异源、原核或真核、天然或人工DNA）与载体DNA接合成一含有自我复制能力DNA分子——复制子(replicon)，继而经过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目标基因转化子细胞，再进行扩增提取取得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)

。基因工程专题知识讲座第35页生物技术工程:

基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目标①分离取得某一感兴趣基因或DNA②取得感兴趣基因表示产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)

——实现基因克隆所用方法及相关工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。基因工程专题知识讲座第36页（二）工具酶

限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶基因工程专题知识讲座第37页重组DNA技术中常见工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常见于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标识等反转录酶合成cDNA替换DNA聚合酶I进行填补，标识或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标识探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基基因工程专题知识讲座第38页限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ基因工程专题知识讲座第39页作用与甲基化酶共同组成细菌限制修饰系统，限制外源DNA，保护本身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常见Ⅱ型）基因工程专题知识讲座第40页第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发觉先后次序。命名HindⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株第三种酶基因工程专题知识讲座第41页Ⅱ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG基因工程专题知识讲座第42页BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口基因工程专题知识讲座第43页同功异源酶起源不一样限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ基因工程专题知识讲座第44页同尾酶有些限制性内切酶即使识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同粘性末端，称为同尾酶。这两个相同粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA基因工程专题知识讲座第45页（三）目标基因

cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)基因工程专题知识讲座第46页（四）基因载体定义为携带目标基因，实现其无性繁殖或表示有意义蛋白质所采取一些DNA分子。常见载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA基因工程专题知识讲座第47页克隆载体(cloningvector)为使插入外源DNA序列被扩增而特意设计载体称为克隆载体。表示载体(expressionvector)为使插入外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计载体称为表示载体。基因工程专题知识讲座第48页载体选择标准能自主复制；含有两个以上遗传标识物，便于重组体筛选和判定；有克隆位点（外源DNA插入点），常含有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大外源DNA。基因工程专题知识讲座第49页1.质粒

(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有一些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。基因工程专题知识讲座第50页目录基因工程专题知识讲座第51页基因工程专题知识讲座第52页λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)

M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列基因工程专题知识讲座第53页3.粘性质粒(cosmid)基因工程专题知识讲座第54页酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其它基因工程专题知识讲座第55页二、重组DNA技术基础原理基础原理目标基因获取DNA导入受体菌外源基因与载体连接克隆载体选择和构建重组体筛选克隆基因表示

基因工程专题知识讲座第56页

以质粒为载体

DNA

克隆过程目录基因工程专题知识讲座第57页（一）目标基因获取1.化学合成法要求：已知目标基因核苷酸序列或其产物氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

（见第22章）基因工程专题知识讲座第58页*化学合成法获取目标基因由已知氨基酸序列推测可能DNA序列基因工程专题知识讲座第59页组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带全部基因组DNA集合*从基因组DNA文库获取目标基因目录基因工程专题知识讲座第60页限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶个别消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录基因工程专题知识讲座第61页mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目标基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录基因工程专题知识讲座第62页（三）外源基因与载体连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不一样限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体选择和构建基因工程专题知识讲座第63页BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目标基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目标基因自连同一限制酶切位点连接目录基因工程专题知识讲座第64页不一样限制酶切位点（非配伍末端）连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端连接情况和同一限制酶切位点连接相同。目录基因工程专题知识讲座第65页2.平端连接适合用于：限制性内切酶切割产生平端粘端补齐或切平形成平端基因工程专题知识讲座第66页目标基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目标基因自连目录基因工程专题知识讲座第67页3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。基因工程专题知识讲座第68页5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目标基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录基因工程专题知识讲座第69页4.人工接头(linker)连接由平端加上新酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

基因工程专题知识讲座第70页人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录基因工程专题知识讲座第71页受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺点处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌基因工程专题知识讲座第72页（五）重组体筛选

1.直接选择法(1)

抗药性标识选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹

2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等基因工程专题知识讲座第73页(插入失活法)抗药性标识选择目录基因工程专题知识讲座第74页组氨酸缺点型大肠杆菌无组氨酸培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录基因工程专题知识讲座第75页α互补目录基因工程专题知识讲座第76页α互补检测目录基因工程专题知识讲座第77页原位杂交目录基因工程专题知识讲座第78页Southern印迹目录基因工程专题知识讲座第79页鸡β肌球蛋白克隆和检出目录基因工程专题知识讲座第80页重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目标基因切限制酶切目标基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体基因工程专题知识讲座第81页重组DNA技术操作主要步骤载体质粒噬菌体病毒目标基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目标基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体宿主筛选表型筛选酶切电泳判定菌落原位杂交目录基因工程专题知识讲座第82页表示体系建立表示载体构建受体细胞建立表示产物分离纯化（六）克隆基因表示基因工程专题知识讲座第83页1.原核表示体系（E.coli表示体系最为常见）标准：选择标志 强开启子翻译调控序列 多接头克隆位点E.coli表示体系不足

不宜表示真核基因组DNA不能加工表示真核蛋白质表示蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)

极难表示大量可溶性蛋白基因工程专题知识讲座第84页大鼠胰岛素原cDNA表示和分泌 目录基因工程专题知识讲座第85页