基因工程酵母基因工程

基因工程酵母基因工程基因工程酵母基因工程第1页E酵母菌表示系统C酵母菌载体系统B酵母菌宿主系统A酵母菌作为表示外源基因受体菌特征F利用重组酵母生产乙肝疫苗D酵母菌转化系统基因工程酵母基因工程第2页A酵母菌作为表示外源基因受体菌特征酵母菌分类学特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。酵母菌是最成熟真核生物表示系统。基因工程酵母基因工程第3页A酵母菌作为表示外源基因受体菌特征酵母菌表示外源基因优势全基因组测序，基因表示调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表示产物分泌至培养基中含有原核细菌无法比拟真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全基因工程受体系统(GenerallyRecognizedAsSafeGRAS)酵母菌是最简单真核模式生物基因工程酵母基因工程第4页B酵母菌宿主系统提升重组蛋白表示产率突变宿主菌抑制超糖基化作用突变宿主菌降低泛素依赖型蛋白降解作用突变宿主菌广泛用于外源基因表示酵母宿主菌基因工程酵母基因工程第5页当前已广泛用于外源基因表示和研究酵母菌包含：酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）其中酿酒酵母遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表示外源基因最理想。基因工程酵母基因工程第6页提升重组蛋白表示产率突变宿主菌能造成酿酒酵母中重组蛋白产量提升或质量改进突变类型ssc1

改进重组蛋白分泌ssc2

提升重组蛋白表示rgr1

提升重组蛋白表示ose1

提升重组蛋白表示ssc11改进重组蛋白分泌rho-

提升重组蛋白表示突变类型生物效应基因工程酵母基因工程第7页抑制超糖基化作用突变宿主菌能抑制超糖基化突变类型mnn甘露糖生物合成缺点型alg天门冬酰胺侧链糖基化缺点型och外侧糖链添加缺点型突变类型生物效应

许多真核生物蛋白质在其天冬酰胺侧链上接有寡糖基团，经常影响蛋白质生物活性。整个糖单位由糖基关键和外侧糖链两个别组成。酵母菌普遍拥有蛋白质糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白糖基化反应极难控制，呈超糖基化倾向，所以选择超糖基化缺点株非常主要。基因工程酵母基因工程第8页降低泛素依赖型蛋白降解作用突变宿主菌泛素介导蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白基因工程酵母基因工程第9页酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI1编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长久表示稳定时关闭UBI2编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长久表示稳定时关闭UBI3编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长久表示稳定时关闭UBI4编码泛素五聚体对数生长久关闭稳定时表示酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7基因工程酵母基因工程第10页泛素降解路径衰减酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表示，UBI4-突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子浓度比野生株要低得多，所以UBI4缺点突变株是外源基因表示理想受体UBI4缺点型：Ubc4-ubc5双突变型：泛素连接酶基因突变对衰减蛋白降解作用一样有效基因工程酵母基因工程第11页C酵母菌载体系统酵母菌克隆表示质粒构建酵母菌中野生型质粒基因工程酵母基因工程第12页酵母菌中野生型质粒酿酒酵母中2m环状质粒几乎全部酿酒酵母中都含有2m双链环状质粒，拷贝数达50至100个。基因工程酵母基因工程第13页酵母菌克隆表示质粒构建含有ARSYRp质粒构建酵母菌自主复制型质粒构建组成包含自主复制序列、标识基因、克隆位点、大肠杆菌质粒DNA。以ARS为复制子质粒称为YRp。以2m质粒上复制元件为复制子质粒称为YEp。上述两类质粒在酿酒酵母中拷贝数最高可达200个，但培养几代后，质粒丢失率高达50%-70%，主要是因为分配不均匀所致。基因工程酵母基因工程第14页含有CENYCp质粒构建CEN为酵母菌染色体DNA着丝粒区，与染色体均匀分配相关序列。将CENDNA插入含ARS质粒中，取得新载体称为YCp。YCp质粒含有较高有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个。含有TELYAC质粒构建基因工程酵母基因工程第15页含有酵母菌染色体DNA同源序列YIp质粒构建

在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标识基因，构建出来质粒称为Yip。目标基因表示盒通常插在染色体DNA特定序列中，这么目标基因就能高效整合入酵母菌特定染色体DNA区域。基因工程酵母基因工程第16页D酵母菌转化系统转化质粒在酵母细胞中命运酵母菌转化程序用于转化子筛选标识基因基因工程酵母基因工程第17页碱金属离子介导酵母菌完整细胞转化

酿酒酵母完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且含有以下特征：吸收线型DNA能力显著大于环状DNA，二者相差80倍共转化现象极少发生酵母菌转化程序基因工程酵母基因工程第18页酵母菌电击转化法优点：不依赖于受体细胞遗传特征培养轻易转化率可高达105/mgDNA。基因工程酵母基因工程第19页转化质粒在酵母细胞中命运单链转化率是双链10-30倍含有复制子单链质粒进入细胞转化为双链并复制不含复制子单链质粒进入细胞后能高效地同源整合克隆在YIp整合型质粒上外源基因，假如含有染色体DNA同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数50-80%基因工程酵母基因工程第20页用于转化子筛选标识基因用于酵母菌转化子筛选标识基因主要有营养缺点型互补基因和显性基因两大类营养缺点型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA

但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺点型受体非常困难营养缺点型互补基因基因工程酵母基因工程第21页显性标识基因编码产物是毒性物质抗性蛋白显性标识基因aph

氨基糖苷转移酶抗G418cat

氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr

二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

铜离子螯合物耐受铜离子suc2

蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂标识基因编码产物遗传表型基因工程酵母基因工程第22页E酵母菌表示系统外源基因在酵母菌中表示限制原因酵母菌开启子可控性酵母菌表示系统选择基因工程酵母基因工程第23页酵母菌开启子可控性pho4TS-PHO5开启子：酿酒酵母中PHO5开启子正调控因子是PHO4PHO4温度敏感型突变基因pho4TS编码产物在35℃时失活装在pho4TS-PHO5开启子下游外源基因在35℃时关闭23℃诱导表示温度控制型开启子基因工程酵母基因工程第24页a–a型开启子：酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表示a2因子阻遏a细胞特征表示a1-a2阻遏a细胞特征表示编码a2因子基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型。温度控制型开启子a型开启子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型开启子受体细胞基因组重组质粒a型开启子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型开启子a2a125℃35℃基因工程酵母基因工程第25页酿酒酵母半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和

GAL10基因编码超诱导型开启子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导效果不显著，基因基底水平表示GeneXUASGAL4GAL80半乳糖诱导时，GAL4高效表示，外源基因受诱导且超高效表示GAL10Promoter限制因子基因工程酵母基因工程第26页外源基因在酵母菌中表示限制原因外源基因稳态mRNA浓度外源基因mRNA翻译活性酵母菌对密码子偏爱性在酿酒酵母中，高丰度蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上氨基酸是由25个密码子编码基因工程酵母基因工程第27页酵母菌表示系统选择酿酒酵母基因表示系统最为成熟，各种重组外源蛋白取得成功表示。但最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白与细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺点可用非酿酒酵母型表示系统来填补。酿酒酵母表示系统基因工程酵母基因工程第28页乳酸克鲁维酵母双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产高效表示稳定性载体，即便在无选择压力条件下，也能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表示系统乳酸克鲁维酵母表示分泌型和非分泌型重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表示系统。基因工程酵母基因工程第29页巴斯德毕赤酵母是一个甲基营养菌，能在低廉甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢路径中各酶编码基因表示，所以生长快速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强开启子、表示可诱导性是巴斯德毕赤酵母表示系统三大优势。巴斯德毕赤酵母表示系统外源基因普通整合入染色体DNA上。表示水平取决于整合拷贝数。当前已经有20余种含有经济价值重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中取得成功表示。基因工程酵母基因工程第30页重组多型汉逊酵母构建也是采取整合策略。当前，包含乙型肝炎表面抗原在内数种外源蛋白在该系统中取得成功表示。多型汉逊酵母表示系统基因工程酵母基因工程第31页F利用重组酵母生产乙肝疫苗由乙型肝炎病毒（HBV）感染引发急慢性乙型肝炎是一个严重传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一个别人可能转化为肝硬化或肝癌患者。当前对乙型肝炎病毒还没有一个有效治疗药品，所以高纯度乙型疫苗生产对预防病毒感染含有重大社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠确保。基因工程酵母基因工程第32页产乙肝表面抗原重组酿酒酵母产乙肝表面抗原重组巴斯德毕赤酵母基因工程酵母基因工程第33页乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，所以第一代乙肝疫苗是从病毒携带者肝细胞质膜上提取出来。即使这种质膜起源疫苗含有较高免疫原性，但因