布鲁氏菌试管凝集试验

布鲁氏菌试管凝集试验布鲁氏菌试管凝集试验第1页

免疫学基础

布鲁氏菌试管凝集试验第2页因为布鲁氏菌培养营养条件苛刻而且时间长，所以布鲁氏菌血清学诊疗越来越受到重视。布鲁氏菌试管凝集试验第3页

主要是依据对应抗原抗体能够在体外发生特异性结合并展现可见反应原理,用已知抗原(或抗体)检测体液中未知抗体(或抗原).因为试验时通常是用患者血清作为待检材料,所以检测抗原抗体体外试验又称为血清学试验或血清学反应.布鲁氏菌试管凝集试验第4页血清学检验既可帮助早期诊疗，还可确定是否复发或重复感染。感染1-2周后，患者血清中出现IgM抗体，能够用凝集试验或抗人球蛋白试验检测．感染３周后，患者血清中出现IgG抗体，能够用补体结合试验，荧光抗体或ELISA检测．布鲁氏菌试管凝集试验第5页

虎红平板凝集反应（RBPT）布鲁氏菌试管凝集试验第6页

原理该试验又称为班氏孟加拉红平板凝集试验。因为所用抗原是酸性（PH3.6—3.9）带色抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中IgM类抗体凝集活性、检验出抗体是IgG类，所以提升了该项反应特异性。布鲁氏菌试管凝集试验第7页

器材与试剂虎红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂玻片或有凹形孔玻片、0.1ml吸管或微量加样器、混合棒或牙签布鲁氏菌试管凝集试验第8页

试验方法在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03ml，充分混匀，在5分钟内观察结果。布鲁氏菌试管凝集试验第9页(四)结果判定有二种方法，第一个是，出现可见凝集反应就判为阳性；另一个用“+”表示凝集程度按以下标准用加号统计反应强度：++++：出现大凝聚片或小粒状物，液体完全透明，100%凝集+++：有显著凝聚片，液体几乎完全透明，75%凝集++：有可见凝集片，液体不甚透明，50%凝集+：液体混浊，只有少许粒状物，25%凝集-：液体均匀混浊布鲁氏菌试管凝集试验第10页评价此法简便、快速、轻易操作，适于基层大面积检疫；此法有一定敏感性，检验牛阳性率稍高于绵羊、山羊。因为在酸性环境下IgM活性受抑，该法主要是检验IgG类凝集抗体，所以特异性很好，与补体结合试验、二巯基乙醇（2-ME）试验和抗球蛋白（Coomb’s0）试验有较高吻合率。该法受制备抗原时条件影响较大，所以每批制备抗原应给予检验、标化方可应用。布鲁氏菌试管凝集试验第11页布鲁氏菌试管凝集试验第12页

试管凝集试验布鲁氏菌试管凝集试验第13页试管凝集试验原理

1897年莱特氏等(Wright)与其同事发觉患该病病人血清与马尔他细菌培养物产生了凝集现象，遂称之为莱特氏凝集反应，成了迄今常见血清学诊疗方法之一。布鲁氏菌试管凝集试验第14页设备及试剂试管凝集抗原被检血清0.5%石碳酸生理盐水吸管试管试管架孵箱布鲁氏菌试管凝集试验第15页操作步骤

被检血清稀释:普通情况下,每份血清用5支小试管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理盐水,第二管不加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸管吸收被检血清0.2毫升,加入第一管中,混匀。混匀后,以该吸管吸收第一管中血清加入第二和第三管各0.5毫升，以该吸管将第三管混匀，并吸收0.5毫升加入第四管,依次稀释到第五管,混匀后从第五管吸出0.5毫升弃去.如此稀释后,从第二管起血清稀释度分别为1:12.51:251:501:100布鲁氏菌试管凝集试验第16页操作步骤加入抗原:先以0.5%石碳酸生理盐水将抗原原液做适当稀释（普通是作1:10稀释）,稀释后抗原加入各稀释血清管（第一管不加，作为血清对照）,每管0.5毫升,混匀。加入抗原后，第二管至第五管每管总量为1毫升，从第二管起血清稀释度分别为1:251:501:1001:200，从第一管再吸出0.5毫升，剩1毫升。对照管制作:抗原对照（适当稀释抗原加石碳酸盐水）被检血清对照阴性对照（阴性血清稀释后加抗原）阳性对照（阳性血清稀释到原有滴度加抗原）布鲁氏菌试管凝集试验第17页然后将试验管和对照管充分混匀后，放于37℃温箱中20-22小时后取出，在室温下放置2个小时，以比浊管为标准判定结果。布鲁氏菌试管凝集试验第18页

结果判定判定比浊管制备:每次试验须配制比浊管作为判定标准依据.配制方法是:取此次试验用抗原稀释液（普通1:10）5-10毫升，加入等量0.5%石碳酸生理盐水作倍比稀释，按下表配制比浊管比浊管配制布鲁氏菌试管凝集试验第19页

试管凝集反应标准比浊管配制

管号抗原稀释液（ml）生理盐水（ml）透明度标识10.001.00100%++++20.250.7575%+++30.500.5050%++40.750.2525%＋51.000.000%－布鲁氏菌试管凝集试验第20页结果统计依据各管中上层液体清亮程度统计结果，尤其是50%清亮度（++）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定血清对照为清亮透明无沉淀,抗原对照为均匀混浊在两种对照管都成立情况下，才可判定试验管，不然应重做。对沉淀需要经验判定。布鲁氏菌试管凝集试验第21页

“+++”几乎完全凝集，上清液75%清亮“++”显著凝集，上清液50%清亮“+”微量凝集，液体25%清亮“-”无凝集，液体不清亮确定每份血清滴度是以出现“++”及以上凝集现象最高血清稀释度“++++”完全凝集，上清液100%清亮布鲁氏菌试管凝集试验第22页诊疗标准没有进行过菌苗接种人、畜血清试验标准是：人、牛、马、鹿、骆驼等大家畜血清为1：100(++)及以上者为阳性，1：50(++)为可疑。猪、羊(绵羊、山羊)、犬等小家畜血清在1：50(++)及以上者为阳性，1：25(++)为可疑。对可疑反应人和动物应在10-25天内重复检验，方便深入确定诊疗。布鲁氏菌试管凝集试验第23页影响试验结果原因及注意事项

受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温度不能超出10℃，采血后应于3—4日内进行检验，因放置时间过长可能会造成血清效价降低。

恪守操作规程：所用器材要清洁、干燥，试剂加量一定要正确，放入温箱温度和时间都要按要求，不然都影响结果。每份血清和抗原均要有对照。高渗盐水作凝集反应，普通浓度在10~12%，普通切记人血清不能用高渗盐水。布鲁氏菌试管凝集试验第24页作凝集反应时，有个别血清会出现前带现象，即稀释度低血清管内(或血清量多格)不发生凝集，而稀释度高管内(或血清量少格)出现凝集，这叫做前带现象。假如某血清在平板凝集反应中出现了前带现象，那么做试管反应时应多做几个管，多采取几个稀释度。

氯化钠含量增高对血清反应有显著影响，盐浓度越高，反应敏感性提升，所以在兽医界为了克服凝集反应中阻抑抗体干扰，对羊血清采取高渗盐水作凝集反应，普通浓度在10~12%，切记普通人血清不能用高渗盐水。布鲁氏菌试管凝集试验第25页

前带现象产生原因①胶体粒子学说：血清稀释度低所含胶体粒子多，它影响抗原抗体结合，而稀释度高则含胶体粒子少，所以出现凝集。②不完全抗体学说：血清中因存在不完全抗体竞争抗原，所以在低稀释度管中不凝集。③抗原抗体百分比失调，也就是抗体过剩或血清内含有过多防腐剂，严重污染可造成前带现象产生，封闭抗原干扰。布鲁氏菌试管凝集试验第26页评价该方法特异性很好，敏感性也高，所以适合用于检疫和临床诊疗。因为该试验有时出现前带现象和封闭现象，所以有时也出现假阴性结果，必要时和其它方法联合应用。布鲁氏菌试管凝集试验第27页抗原抗体反应特点布鲁氏菌试管凝集试验第28页抗原抗体结合特异性

抗原抗体结合基础是抗原决定簇与抗体抗原结合部位之间反应.这种反应是专一性.比如:布氏杆菌只能与布氏杆菌抗体相结合,而不能与痢疾杆菌抗体相结合.布鲁氏菌试管凝集试验第29页

抗原抗体结合表面性

抗原抗体结合仅仅是分子表面结合，即使二者结合相当稳定，但结合后抗原抗体，其本身结构，生物学活性均未遭到破坏,而且在一定条件下可解离.即抗原抗体结合是可逆,所以,解离抗原抗体复合物方法可用于提取,纯化抗原或抗体.布鲁氏菌试管凝集试验第30页抗原抗体结合适当百分比抗原是多价(分子表面有多个抗原决定簇)，抗体普通是双价，(分子末端有两个抗原结合部位)，所以，二者结合就有一个百分比关系问题．只有抗原抗体百分比适当，才能形成较大，轻易观察复合物．如若百分比不妥,就不能形成较大复合物.所以试验时要依据不一样情况反抗原抗体(甚至二者同时)进行连续稀释,方便更加好地提供二者最适百分比.颗粒性抗原,因其分子较大,形成可见凝集物质所需抗体较少,所以试验时普通把含有抗体血清做连续稀释,尽管如此,有时还能在含有较多抗体前列试管中,因二者百分比不妥不展现可见反应,这种现象被称为前带现象.

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抗原抗体结合阶段性

抗原抗体结合分为两个阶段

第一阶段:特异性结合阶段,反应快,只需几秒或几分即可完成.但不出现肉眼可见反应.

第二阶段:抗原抗体结合可见阶段,这一阶段反应是可见,反应较慢,常需几分钟，几十分钟或更久。

布鲁氏菌试管凝集试验第32页抗原抗体反应影响原因电解质；抗原抗体反应必须有适量电解质参加，不然不出现可见反应，普通拿0.85化钠溶液做为抗原或抗体稀释液。温度：适当提升温度能够增多抗原与抗体碰撞机会。促进反应现象加速出现。普通最适温度范围在0-56之间。在这个范围内，温度低，对反应促进作用较小，但生成复合物不易解离。温度高，对反应促进作用较大，但生成复合物轻易解离。实际工作中，多数反应在37进行。在试验过程中，普通在加温之前，适度振摇抗原抗