酵母基因工程

酵母基因工程酵母基因工程第1页基因工程5

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基因工程基础概念基因工程基础原理基因工程所需基础条件基因工程操作过程目标基因克隆与基因文库构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程酵母基因工程第2页E酵母菌表示系统7酵母基因工程C酵母菌载体系统B酵母菌宿主系统A酵母菌作为表示外源基因受体菌特征F利用重组酵母生产乙肝疫苗D酵母菌转化系统酵母基因工程第3页A酵母菌作为表示外源基因受体菌特征7酵母基因工程酵母菌分类学特征

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如果说大肠杆菌是外源基因最成熟原核生物表示系统，则酵母菌是最成熟真核生物表示系统。酵母基因工程第4页A酵母菌作为表示外源基因受体菌特征7酵母基因工程酵母菌表示外源基因优势全基因组测序，基因表示调控机理比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表示产物分泌至培养基中含有原核细菌无法比拟真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全基因工程受体系统（GenerallyRecognizedAsSafeGRAS）酵母菌是最简单真核模式生物酵母基因工程第5页B酵母菌宿主系统7酵母基因工程提升重组蛋白表示产率突变宿主菌抑制超糖基化作用突变宿主菌降低泛素依赖型蛋白降解作用突变宿主菌广泛用于外源基因表示酵母宿主菌酵母基因工程第6页广泛用于外源基因表示酵母宿主菌当前已广泛用于外源基因表示和研究酵母菌包含：酵母属如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）其中酿酒酵母遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表示外源基因最理想。酵母基因工程第7页提升重组蛋白表示产率突变宿主菌能造成酿酒酵母中重组蛋白产量提升或质量改进突变类型ssc1

改进重组蛋白分泌钙离子依赖型ATP酶ssc2

提升重组蛋白表示转录后加工rgr1

提升重组蛋白表示转录水平ose1

提升重组蛋白表示转录水平ssc11

改进重组蛋白分泌羧肽酶Yrho-

提升重组蛋白表示转录水平突变类型生物效应作用位点酵母基因工程第8页抑制超糖基化作用突变宿主菌能抑制超糖基化突变类型mnn甘露糖生物合成缺点型alg天门冬酰胺侧链糖基化缺点型och外侧糖链添加缺点型突变类型生物效应许多真核生物蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们经常影响蛋白质生物活性。整个糖单位由糖基关键和外侧糖链两个别组成。

酵母菌普遍拥有蛋白质糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白糖基化反应极难控制，呈超糖基化倾向，所以超糖基化缺点株非常主要。酵母基因工程第9页降低泛素依赖型蛋白降解作用突变宿主菌泛素介导蛋白质降解作用蛋白酶体LysHOOCUbiquitin76aa

ubiquitinligaseE3

LysubiquitinligaseE3

Lys靶蛋白靶蛋白靶蛋白酵母基因工程第10页降低泛素依赖型蛋白降解作用突变宿主菌酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI1

编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长久表示稳定时关闭UBI2

编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长久表示稳定时关闭UBI3

编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长久表示稳定时关闭UBI4

编码泛素五聚体对数生长久关闭稳定时表示酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7酵母基因工程第11页降低泛素依赖型蛋白降解作用突变宿主菌泛素降解路径衰减酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表示，UBI4-突变株能UBI4缺点型：正常生长，但细胞内游离泛素分子浓度比野生株要低得多，所以UBI4缺点突变株是外源基因表示理想受体UBA1缺点型：UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性，但其等位基因缺点是非致死性，而且也能减弱泛素介导蛋白降解Ubc4-ubc5双突变型：七个泛素连接酶基因突变对衰减蛋白降解作用一样有效酵母基因工程第12页C酵母菌载体系统7酵母基因工程酵母菌克隆表示质粒构建酵母菌中野生型质粒酵母基因工程第13页酵母菌中野生型质粒酿酒酵母中2m环状质粒几乎全部酿酒酵母中都含有2m双链同源重组REP1RAFSTBoriREP2FLPIRIRAB环状质粒，拷贝数达50至100个。IRs反向重复序列，600bp，重组FLP

编码产物驱动IRs同源重组REP

编码产物控制质粒稳定性STB

REP结合位点接合酵母属中pSR1和pSB1，以及克鲁维酵母属中pKD1等均与2m质粒类似。酵母基因工程第14页酵母菌中野生型质粒乳酸克鲁维酵母中线状质粒乳酸克鲁维酵母中含有两种不一样pGKL18.9kbDNA聚合酶毒素蛋白ab免疫蛋白g亚基双链线状质粒pGKL1和pGKL1拷贝数为50-100个，分别携带K1K2两种能使各种酵母菌致死毒反向重复序列素蛋白编码基因（abg），同时含有毒素蛋白抗性基因。酵母基因工程第15页酵母菌克隆表示质粒构建含有ARSYRp质粒构建ARS为酵母菌中自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒构建组成包含复制子、标记基因、提供克隆位点大肠杆菌质粒DNA。

以ARS为复制子质粒称为YRp上述两类质粒在酿酒酵母中拷贝数最高可达200个，但培养几代

以2m质粒上复制元件为复制子质粒称为YEp后，质粒丢失率高达50%-70%，主要是因为分配不均匀所致。酵母基因工程第16页酵母菌克隆表示质粒构建含有CENYCp质粒构建CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配相关序列将CENDNA插入含ARS质粒中，取得新载体称为YCpYCp质粒含有较高有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个含有TELYAC质粒构建酵母基因工程第17页酵母菌克隆表示质粒构建含有酵母菌染色体DNA同源序列YIp质粒构建

在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标识基因，构建出来质粒称为Yip。目标基因表示盒通常插在染色体DNA特定序列中，这么目标基因就能高效整合入酵母菌特定染色体DNA区域酵母基因工程第18页D酵母菌转化系统7酵母基因工程转化质粒在酵母细胞中命运酵母菌转化程序用于转化子筛选标识基因酵母基因工程第19页酵母菌转化程序酵母菌原生质体转化法

早期酵母菌转化都采取在等渗缓冲液中稳定原生质体转化法，在Ca2+和PEG存在下，转化细胞可达原生质体总数1-2%。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率严重制约原生质体转化法一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化原生质体占转化子总数25-33%酵母基因工程第20页酵母菌转化程序碱金属离子介导酵母菌完整细胞转化

酿酒酵母完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且含有以下特征：吸收线型DNA能力显著大于环状DNA，二者相差80倍共转化现象极为罕见酵母基因工程第21页酵母菌转化程序酵母菌电击转化法酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应防止使用PEG，它对受电击细胞含有较很大负作用。电击转化优点是不依赖于受体细胞遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率可高达105/mgDNA。酵母基因工程第22页转化质粒在酵母细胞中命运单双链DNA均可转化酵母菌，但单链转化率是双链10-30倍含有复制子单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制不含复制子单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体这对于体内定点突变酵母基因组极为有利克隆在YIp整合型质粒上外源基因，假如含有受体细胞染色体DNA同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数50-80%酵母基因工程第23页用于转化子筛选标识基因用于酵母菌转化子筛选标识基因主要有营养缺点型互补基因和显性基因两大类

营养缺点型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE

但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺点型受体非常困难营养缺点型互补基因酵母基因工程第24页用于转化子筛选标识基因显性标识基因编码产物只要是毒性物质抗性蛋白显性标识基因aph

氨基糖苷转移酶抗G418cat

氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素dhfr

二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺cup1

铜离子螯合物耐受铜离子suc2

蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖ilv2

乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂标识基因编码产物遗传表型酵母基因工程第25页E酵母菌表示系统7酵母基因工程外源基因在酵母菌中表示限制原因酵母菌开启子可控性酵母菌表示系统选择酵母基因工程第26页酵母菌开启子可控性pho4TS-PHO5开启子：酿酒酵母PHO5开启子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开PHO4基因编码产物是PHO5开启子正调控因子所以，装在pho4TS-PHO5开启子下游外源基因在35℃时关闭23℃诱导表示温度控制型开启子PHO4温度敏感型突变基因pho4TS编码产物在35℃时失活酵母基因工程第27页酵母菌开启子可控性a–a型开启子：酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表示a2因子阻遏a细胞特征表示a1-a2阻遏a细胞特征表示编码a2因子基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型温度控制型开启子a型开启子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型开启子受体细胞基因组重组质粒a型开启子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa

型开启子a2a125℃35℃酵母基因工程第28页酵母菌开启子可控性酿酒酵母超诱导型开启子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导效果不显著，基因基底水平表示GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导时，GAL4高效表示，GAL1、GAL1、GAL10超高效表示GAL10Promoter半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和

GAL10基因编码酵母基因工程第29页外源基因在酵母菌中表示限制原因外源基因稳态mRNA浓度外源基因mRNA翻译活性酵母菌对密码子偏爱性在酿酒酵母中，高丰度蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%以上氨基酸是由25个密码子编码酵母基因工程第30页酵母菌表示系统选择酿酒酵母基因表示系统最为成熟，包含转录活性较高甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酿酒酵母表示系统酶基因ADH所属开启子，各种重组外源蛋白取得成功表示。酿酒酵母表示系统最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺点可用非酿酒酵母型表示系统来填补。酵母基因工程第31页酵母菌表示系统选择

乳酸克鲁维酵母双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产高效表示稳定性载体，即便在无选择压力条件下，也乳酸克鲁维酵母表示系统能稳定遗传40代以上。乳酸克鲁维酵母表示分泌型和非分泌型重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表示系统。酵母基因工程第32页酵母菌表示系统选择巴斯德毕赤酵母是一个甲基营养菌，能在低廉甲醇培养基中生巴斯德毕赤酵母表示系统长，甲醇可高效诱导甲醇代谢路径中各酶编码基因表示，所以生长快速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强开启子、表示可诱导性是巴斯德毕赤酵母表示系统三大优势。因为巴斯德毕赤酵母没有适当自主复制型载体，所以外源基因表示序列普通整合入受体染色体DNA上。在此情况下，外源基因含有经济价值重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中取得成功表示。高效表示在很大程度上取决于整合拷贝数多寡。当前已经有20余种酵母基因工程第33页酵母菌表示系统选择多型汉逊酵母也是一个甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被多型汉逊酵母表示系统克隆，并用于构建克隆表示载体，但与巴斯德毕赤酵母相同，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不一样是，HARS质粒能高频自发地整合在受体染色体DNA上，甚至能够连续整合100多当前，包含乙型肝炎表面抗原在内数种外源蛋白在该系统中获个拷贝，所以重组多型汉逊酵母构建也是采取整合策略。得成功表示。酵母基因工程第34页F利用重组酵母生产乙肝疫苗7酵母基因工程由乙型肝炎病毒（HBV）感染引发急慢性乙型肝炎是一个严重传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一个别人可能转化为肝硬化或肝癌患者。当前对乙型肝炎病毒还没有一个有效治疗药品，所以高纯度乙型疫苗生产对预防病毒感染含有重大社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠确保。酵母基因工程第35页F利用重组酵母生产乙肝疫苗7酵母基因工程产乙肝表面抗原重组酿酒酵母乙型肝炎病毒结构与性质产乙肝表面抗原重组巴斯德毕赤酵母酵母基因工程第36页乙型肝炎病毒结构与性质

乙肝病毒是一个蛋白包裹型双链DNA病毒，含有感染力病毒乙型肝炎病毒结构颗粒呈球面状，直径为42nm，基因组仅为3.2kb。病毒颗粒主要结构蛋白是病毒表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它含有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内蛋白成份包含关键抗原（HBcAg）、除此之外，被乙肝病毒感染人肝脏还能合成并释放大量22病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。nm空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配各种包装蛋白组份1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。酵母基因工程第37页乙型肝炎病毒结构与性质乙型肝炎病毒包装蛋白编码基因ATGATGATGTAA108aa55aa226aapreS1preS2SS多肽226aaM多肽281aaL多肽399aa酵母基因工程第38页乙型肝炎病毒结构与性质

乙肝病毒在体外细胞培养基