聚合酶链反应技术和应用专家讲座

聚合酶链式反应技术及应用分子生物学第9章检验医学院生命科学学院4/25/20231ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第1页聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）技术是生命科学界重大创造，是生物技术领域中最主要四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。PCR最大特点，是能将微量DNA大幅增加。经过体外（试管内）扩增，能够将目标基因（或靶基因）片段百万倍放大，从而到达极大地提升核酸分子检测灵敏度，理论上其检测灵敏度能够到达一个细胞、甚至一个分子水平。

4/25/20232ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第2页PCR创造人，普通公认是凯利﹒穆利斯（K.Mullis,在Cetus企业工作期间，创造了PCR），他也所以取得了1993年诺贝尔化学奖。

1983年4月一个周末晚上，他驾车与一位同事去乡村别墅在蜿蜒乡间公路上开着车，他思绪不停，一段DNA重复复制景像，在他脑海里冒了出来。他萌发了PCR构想。PCR发展简史4/25/20233ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第3页引物引物Mullis构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年Mullis开车时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA两条链，自己车和对面开来车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……4/25/20234ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第4页生物学领域基因、DNA片段克隆扩增目标基因和检定重组子DNA序列测定基因功效和表示调控研究制备单链模版致突变……PCR应用领域4/25/20235ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第5页医学领域疾病基因检测/遗传病产前诊疗致病病原体检测肿瘤治疗中癌基因检测

会推广到大部分疾病治疗前检测

DNA指纹、个体识别、亲子关系判别、法医物证其它:

动、植物检疫（转基因动植物检测）

4/25/20236ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第6页PCR技术基本原理是DNA半保留复制，在模板DNA、引物和四种dNTP存在条件下，依赖于DNA聚合酶酶促反应。在体内，DNA复制是周期性，所以基因扩增数量有限；PCR技术在体外利用人工合成引物，再加上DNA聚合酶和一些适当底物和因子，经过对温度控制，使DNA不停位于变性、复性和合成循环中，到达扩增DNA目标。2.PCR基本原理4/25/20237ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第7页模板DNA94℃变性55℃退火72℃引物延伸第二次循环模板变性退火延伸图6-1PCR原理示意图4/25/20238ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第8页1234522557294时间（min）温度（℃）PCR基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目标DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍4/25/20239ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第9页PCR产物生成曲线扩增产物循环次数指数扩增期扩增平台期4/25/202310ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第10页反应体系：（五要素）

模板（template）引物(primer)人工合成两段寡核苷酸序列，决定RCP特异性。3.PCR反应体系和反应条件DNA

RNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因组DNA质粒DNA4/25/202311ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第11页PCR反应成功扩增一个关键条件在于寡核苷酸引物正确设计。引物设计目标是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发频率，特异性不好或劣等引物会产生额外无关和不想要PCR扩增子；引发效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增产物与理论上成倍增加量靠近程度。4/25/202312ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第12页引物长度

经典引物为18-24个核苷酸，在一定范围内引物需要足够长，确保序列独特征，并降低序列存在于非目标序列位点可能性；引物长度上限主要与反应效率相关，所以普通又不能太长，因为过长会造成其延伸温度大于72℃，即Taq酶最适温度。引物设计基本标准4/25/202313ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第13页PCR产物长度普通来说，PCR产物长度对扩增效率有影响。扩增片段长度在普通PCR以200～500bp为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。4/25/202314ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第14页引物均衡性和GC含量引物中碱基组成应尽可能随机分布，防止出现嘌呤或嘧啶碱基堆积现象。有效引物中(G+C)百分比为40-60%，过高(非特异性扩增)或过低（特异性降低）都不利于引发反应。上下游引物GC含量不能相差太大。4/25/202315ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第15页引物溶解温度（Tm值）引物Tm值普通控制在55-60度,尽可能确保上下游引物Tm值一致,普通不超出2度.假如引物中G+C含量相对偏低,则能够使引物长度稍长,而确保一定退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)4/25/202316ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第16页引物本身

引物间3’端互补、二聚体或发夹结构也可能造成PCR反应失败;引物3’端几个碱基与模板DNA需严格配对，并最好为低稳定性结构。5’端序列对PCR影响不如3’端大，惯用来引进修饰位点或标识物。

4/25/202317ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第17页使用PrimerPremier5.0等软件设计PCR引物进行引物设计时，点击

按钮，界面以下：

4/25/202318ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第18页4/25/202319ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第19页4/25/202320ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第20页4/25/202321ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第21页-

DNA聚合酶(DNApolymerase)

PCR创造早期，不耐热Klenow片段耐热TaqDNA聚合酶－良好热稳定性：92.5、95、97.5℃时，半衰期分别为130、40、5～6min；－良好延伸效率：在75～80℃时延伸效率最高，每个酶蛋白分子延伸速度可达150个核苷酸/s；－无3′－5′外切酶活性，缺乏校正功效；4/25/202322ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第22页dNTP:包含dATP、dTTP、dGTP、dCTP-PCRbuffer:普通组成：50mMKCl,10-50mM,Tris-Cl(室温PH8.3)，1.5mMMgCl2

KCl：促进引物退火，高浓度KCl抑制TaqDNA聚合酶活性；Tris-Cl：调整pH值，使反应体系偏碱性；MgCl2：调整TaqDNA聚合酶活性、影响引物退火，PCR产物特异性等4/25/202323ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第23页1）PCR反应成份（1）模板普通100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会造成反应非特异性增加。PCR反应条件4/25/202324ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第24页（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L浓度过高易造成模板与引物错配,反应特异性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)

0.5-5U/100l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。4/25/202325ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第25页（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段长度

四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶活性。4/25/202326ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第26页（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。对于大多数PCR引物来说，Mg2+浓度为1.5mmol/L是适宜，假如扩增效果不好，则调整镁离子浓度可能会有所帮助。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等浓度影响反应中游离Mg2+浓度。4/25/202327ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第27页2）循环参数变性使双链DNA解链为单链94℃,30s～1min。(2)退火温度由引物长度和GC含量决定，普通比引物Tm值约低5℃。增加温度能降低引物与模板非特异性结合;降低温度可增加反应灵敏性，但特异性低。热开启：在第一轮扩增前必须使模版DNA完全变性，普通94℃，变性5分钟4/25/202328ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第28页（3）延伸70-75℃,普通为72℃延伸时间由扩增片段长度决定。（1~3min)（4）循环次数主要取决于模版DNA浓度普通为25-30次次数过多：产生“平台效应”错误掺入率增加4/25/202329ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第29页4.PCR扩增产物检测方法凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法PCR产物测序荧光PCR4/25/202330ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第30页(一)琼脂糖凝胶电泳法基本原理：DNA在电泳缓冲液中带负电荷，将PCR产物点样于负极端加样孔，在电场力作用下DNA涌向正极，而且因为电荷效应和分子筛效应，不一样DNA分子量及构型DNA涌动率不一样；在电泳过程中，凝胶中EB将嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EB-DNA复合物发出橙红色荧光，荧光强度与DNA含量成正比；不一样浓度凝胶分辨DNA有效范围不一样。操作简单，但存在EB污染。4/25/202331ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第31页聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途特点：分辨力高，长度仅相差1bpDNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收DNA纯度高；采取银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且防止EB易退色弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。4/25/202332ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第32页(二)PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不一样限制性核酸内切酶可识别特异DNA序列，所以用特定限制性核酸内切酶对目标DNA分子进行消化，得到酶切片段其大小和数量能够在一定程度上反应出目标DNA分子序列信息用途：传染病病原体基因分型人类基因变异性研究。是诊疗遗传病和传染病病原体基因分型惯用方法4/25/202333ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第33页PCR-RFLP法：

限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶4/25/202334ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第34页(三)单链构型多态性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，简称PCR-SSCP）本法就是将PCR产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，因为DNA分子在凝胶中电泳迁移率与其分子量和空间结构相关，而空间结构又与ssDNA序列相关。所以，电泳结束后，ssDNA带位置差异即可反应出PCR产物序列差异。4/25/202335ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第35页PCR-SSCP过程

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP掺入PCR扩增产物

↓

变性↓

单链DNA↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓12345自显影↓1.为正常结果分析2、4、5纯合患者3.为杂合子

.

解链构像DAN原理过程4/25/202336ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第36页优点及作用：方法简便、快速、灵敏，不需要特殊仪器，适合临床试验需要。该方法和其它方法相比有较高检测率。首先，它能够发觉靶DNA片段中未知位置碱基突变。经试验证实小于300bpDNA片段中单碱基突变，90%可被SSCP发觉，另外，SSCP方法可经过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不一样迁移率突变单链DNA分离，而且还能够深入提纯。用这种方法能够最终从DNA序列水平上判别突变DNA片段。不足之处：只能作为一个突变检测方法，要最终确定突变位置和类型，还需深入测序；电泳条件要求较严格；另外，因为SSCP是依据点突变引发单链DNA分子立体构象改变来实现电泳分离，这么就可能会出现当一些位置点突变对单链DNA分子立体构象改变不起作用或作用很小时，再加上其它条件影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。4/25/202337ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第37页(四)核酸探针杂交法(1)点杂交（dotblot）(2)反向点杂交（reversedotblot）(3)微孔板夹心杂交（microplatehybridization）(4)荧光探针杂交(5)Southern印迹杂交（Southernblot）4/25/202338ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第38页样品正对照负对照标准分子量污染是PCR试验常见问题。只要试验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后试验中发生污染。所以，做试验时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个方法5.PCR常见问题及分析4/25/202339ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第39页(1)假阳性①PCR产物是最主要污染源。②阳性对照污染。③标本之间交叉污染。④在采集标本时，其它污染源带来污染。⑤使用带有污染试剂。预防办法：4/25/202340ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第40页(2)假阴性假阴性是PCR反应中另一个易出现问题。造成原因也比较多。能够归纳以下几方面原因。1)标本处理原因。①处理标本时，靶DNA丢失。②处理标本时，杂质成份没有去除洁净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。③标本放置不妥，模板发生降解（尤其是RNA）。4/25/202341ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第41页2)PCR试剂问题。

①引物设计不合理。②TaqDNA聚合酶失活。

③Mg2+浓度过低或是没有加。3)PCR扩增过程中问题①PCR扩增仪故障。②PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。

4)PCR产物判定中问题①电泳时没有加溴化乙锭。②电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。③凝胶浓度过低，使扩增带跑散。4/25/202342ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第42页(3)引物二聚体形成引物二聚体原因有：⑴两个相同或不一样引物分子之间有较多碱基配对，尤其是引物3′端有互补区。⑵引物百分比太高，可增加模板用量。⑶退火温度过低。⑷热循环次数过多。4/25/202343ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第43页(4)非特异性PCR产物造成非特异性PCR产物常见原因及其预防办法：①引物特异性不高或用量太大，应更换引物或降低用量；②TaqDNA聚合酶质量不好或用量太大，应更换酶或降低酶使用量；③Mg2+浓度过高，可适当调整其浓度；④退火温度过低，可提升退火温度；⑤延伸时间过长，可降低延伸时间；⑥热循环次数过多，应适当增加模板量，降低循环次数。4/25/202344ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第44页6.PCR技术发展巢式PCR（nestedPCR）逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplexPCR)重组PCR(recombinantPCR)锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不对称PCR（asymmetricPCR）反向PCR（inversePCR）扩增加片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫PCR(immuno-PCR)原位PCR(insituPCR)差示PCR（DD-PCR）定量PCR4/25/202345ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第45页图6-3巢式PCR原理示意图外引物1外引物2内引物1内引物2第一次PCR第二次PCR（一）巢式PCR（nestedPCR）

4/25/202346ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第46页提升反应特异性4/25/202347ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第47页RNA模板逆转录酶DNA-RNA

杂化双链RNA酶单链cDNAＤＮＡ聚合酶双链cDNA（二）逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）4/25/202348ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第48页one-stepRT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、TaqDNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA

为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR。TthDNA聚合酶含有逆转录功效和DNA聚合功效。惯用逆转录酶有AMV逆转录酶（最适温度为42℃）和MoMLV逆转录酶（最适温度为37℃），惯用逆转录引物有三种：①随机引物；②Oligo（dT），只适合于3′端带有poly(A)尾mRNA；③特异性引物，只适合于逆转录目标RNA序列。以逆转录产物cDNA为模板，再做PCR。4/25/202349ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第49页经济4/25/202350ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第50页（三）多重PCR（multiplexPCR）

PCR普通由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此伎俩诊疗疾病效率低。为提升效率，常采取多重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，因为每对引物扩增片段长度不一样，可用电泳加以判别。多重PCR主要用于各种病原微生物同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因分型判定。4/25/202351ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第51页用于检测特定基因序列存在或缺失。电泳引物4/25/202352ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第52页乳头瘤病毒（ＨＰＶ）检验及分型

宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性中仅次于乳腺癌。我国每年有宫颈癌新发病例１３.１５万，占世界宫颈癌新发病例总数２８.２％。临床科学研究表明，ＨＰＶ连续感染是造成宫颈癌直接原因。ＨＰＶ可分为高危型和低危型两种，不一样ＨＰＶ亚型在致癌性方面存在很大差异。至今发觉ＨＰＶ病毒约有１２３种，最少有２０种高危型ＨＰＶ会组成子宫颈癌。所以提早诊疗ＨＰＶ感染，对ＨＰＶ尤其是高危型ＨＰＶ进行检验和分型极为主要。

4/25/202353ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第53页（四）重组PCR（recombinantPCR）将两个不相邻DNA片段重组在一起PCR称为重组PCR。该技术主要应用于DNA片段任何位置引入点突变、插入、缺失以及两个不相邻片段连接。其基本原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一个物质几个基因片段部分碱基设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多出引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到产物是一重组合DNA。4/25/202354ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第54页引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，变性和复性延伸异源部分双链DNA形成5'5'5'5’5'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'5'5'5'5'5'5'PCR引物a引物d再次PCR5'5'3'3'（四）重组PCR（recombinantPCR）4/25/202355ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第55页（五）锚定PCR（anchoredPCR，APCR）用于扩增已知一端序列目标DNA4/25/202356ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第56页（六）不对称PCR（asymmetricPCR）其基本原理是：采取两条不一样浓度引物，即非限制引物（高浓度引物）与限制性引物（低浓度引物），二者之比为50～100:1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA（dsDNA）；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导PCR就会产生大量单链DNA（ssDNA）。尽管此时单链DNA仅以线性速率递增，但其浓度已能满足双脱氧链终止法测定DNA序列要求。4/25/202357ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第57页已知序列PCR用途：未知序列研究限制酶切点（X）限制酶切点（X）限制酶X酶切连接未知序列（七）反向PCR（inversePCR）4/25/202358ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第58页（八）定量PCR（QuantitivePolymeraseChainReaction，QPCR）以参考物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而到达评定样本中靶基因拷贝数，称为定量PCR。定量PCR可行性定量普通是在PCR扩增指数期进行。定量PCR定量理论依据：理想扩增结果：Y=X×2n其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中原始模板数n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物伴随循环进行成指数增加，但实际上：DNA每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2倍增加；实际应为：Y=X(1+E)n，其中E代表扩增效率：E=参加复制模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变。通常X在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E相对稳定，原始模板以相对固定指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓指数期；4/25/202359ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第59页1．PCR定量DNA一个或两个拷贝特定靶序列细胞株即是标准一个理想起源，也可使用含特定靶序列质粒DNA作为对照，将待检样品与一系列稀释标准对照一起扩增，检测PCR产物，即可推知靶序列含量。2．PCR定量mRNA(1)mRNA相对定量－靶基因扩增产物量与内源性对照扩增产物量比值(2)竞争性PCR定量mRNA(3)cRNA标准曲线法定量mRNA4/25/202360ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第60页荧光定量PCR（FQ-PCR）基于荧光能量传递技术（FRET），是距离很近两个荧光分子间产生一个能量转移现象。当供体荧光分子发射光谱与受体荧光分子吸收光谱重合，而且两个分子距离在10nm范围以内时，就会发生一个非放射性能量转移，即FRET现象，使得供体荧光强度比它单独存在时要低多（荧光猝灭），而受体发射荧光却大大增强（敏化荧光）。荧光定量PCR技术4/25/202361ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第61页受体荧光染料发射出荧光讯号强度与DNA产量成正比，检测PCR过程荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。4/25/202362ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第62页实时荧光定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析方法。与普通PCR区分普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增指数期对起始模板进行定量。4/25/202363ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第63页荧光信号怎样产生？怎样对初始模板定量?RealtimePCR实时监测系统4/25/202364ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第64页线性基线期：扩增最初10～15个循环，此时，PCR反应处于起始阶段，扩增产物极少，产生荧光信号很低；指数期早期：进入指数期早期，荧光强度到达一个阈值,为基线荧光信号均值标准差10倍。指数期：PCR到达其最大扩增阶段，理想条件下，每循环一次，产物倍比增加。平台期：此时荧光信号不再随扩增循环数增加而增加。PCR扩增4个主要阶段4/25/202365ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第65页相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性4/25/202366ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第66页Ct值:扩增产物荧光信号到达设定阈值时所经过扩增循环数。此时扩增是呈对数期增加。Ct值概念ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04阈值线Ct值Ct值怎样对初始模板定量？4/25/202367ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第67页荧光定量PCR原理理想PCR反应：X=X0*2n非理想PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应循环次数X：第n次循环后产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率XCt=X0(1+Ex)Ct=NlogX0=-

log(1+Ex)*Ct+logNXCt:荧光扩增信号到达阈值强度时扩增产物量.在阈值线设定以后,它是一个常数最终结论：LogX0与Ct呈线性关系，依据样品扩增Ct值就可计算出样品中所含模板量4/25/202368ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第68页

标准曲线（使用外参考物定量PCR）

将已知浓度标准品梯度稀释进行RealtimePCR，就会按照起始DNA浓度由多到少次序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模版对数值之间存在线性关系，就可制作标准曲线。未知浓度样品与标品一样，也可得到Ct值，并将Ct值代入标准曲线，就能够求出未知浓度样品起始模版量。4/25/202369ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第69页荧光信号怎样产生？非特异性荧光标识：1、SYBRGreen特异性荧光标识：2、TaqMan3、MolecularBeacon4/25/202370ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第70页SYBRGreenISYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光（SYBRGreen1结合到双链DNA小沟部位）变性时，DNA双链分开，无荧光在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBRGreen也能和非特异双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析4/25/202371ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第71页SYBR-GreenI5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission双链荧光染料SYBR-GreenI荧光染料原理示意图4/25/202372ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第72页SYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission4/25/202373ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第73页Real-TimePCR，SYBRgreenCycle1Cycle3Cycle2MolecularProbe企业一个专利产品，USPatent5,436,134

1993年7月12日申请4/25/202374ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第74页荧光强度改变是因为温度不停升高双链DNA解离，SGI游离Tm是熔解曲线特征值：SYBRGreenI熔解曲线分析当双链DNA解链二分之一时，荧光信号强度急剧下降，此时温度为溶解温度。Tm值与PCR产物序列相关，对某一PCR扩增产物其值是固定。溶解曲线一次曲线溶解曲线负一次微分曲线4/25/202375ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第75页融解曲线作用采取SYBRGreenI荧光嵌正当检测时，能够经过溶解曲线分析，确认PCR反应特异性特异性产物非特异产物引物二聚体4/25/202376ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics聚合酶链反应技术和应用第76页优点对DNA模板没有选择性，适合用于任何DNA使用方便，无须设计复杂探针灵敏度较高廉价缺点易与非特异性双链结合，产生假阳性但能够经过融解曲线分析，优化反应条件对引物特异性要求较高SYBRgreen优缺点4/25/202377ZhejiangProv