单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目

单核增生李斯特氏菌

检测概述张惠媛6月单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第1页内容介绍李斯特氏菌属单核增生李斯特氏菌生物学特征流行病学致病性试验室危害及其预防检测程序快速检测方法单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第2页李斯特氏菌属李斯特氏菌属（Listeria）普遍存在于环境中，最新分类学研究表明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeriaivanovii）无害李斯特氏菌（Listeriainnocua）斯氏李斯特氏菌（Listeriaseeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeriawelshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeriagrayi）

在李斯特氏菌属六个种中，只有两种致病菌：单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌能够引发老鼠和其它动物发病。不过，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类李斯特氏菌症（listeriosis）相关。所以，李斯特氏菌中最有检测意义是单核增生李斯特氏菌。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第3页生物学特征

---菌体形态及染色特征革兰氏阳性；小、类似球形杆菌，0.4~0.5×0.5~2µm，在有些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细胞彼此连成V形，或成群细胞沿长轴方向平行排列，在较老或生长不良培养物中，可能形成丝状；20-25℃以4根周生鞭毛运动，在37℃只有较少鞭毛或1根鞭毛；无芽孢、无荚膜。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第4页单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第5页生物学特征

---培养特征兼性厌氧；在20--25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。生长温度范围为2-42℃（也有报道在0℃能迟缓生长），最适培养温度为35--37℃。pH范围pH4.4-pH9.6。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第6页生物学特征

---培养特征在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但伴随菌落增大，变得不透明。在5-7%血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上，用45°角入射光照射菌落，经过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第7页生物学特征

---生化反应触酶阳性，氧化酶阴性。能发酵各种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第8页生物学特征

---血清型依据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7”。致病菌株血清型普通为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第9页生物学特征

---抵抗力该菌对理化原因抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长久存活；对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min可杀死此菌；湿热灭菌（121℃，最少15min）和干热灭菌（160-170℃，最少1hr）可杀灭该菌，对紫外线和γ射线敏感；该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素（已产生抗性）、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第10页流行病学

分布：广泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、废水、青储饲料、动植物及其食品中都有该菌存在，所以动物很轻易食入该菌，并经过口腔-粪便路径进行传输寄主范围：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳类和昆虫单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第11页流行病学

据报道，有1-10%人类肠道中存在单核增生李斯特氏菌，4-8%水产品、5-10%奶及其产品、30%以上肉制品及15%以上家禽均被该菌污染。相关食品：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是软奶酪）、冰激凌、生蔬菜、发酵过生肉制作香肠、生和加工过禽肉、各种生肉类、生和烟熏鱼肉。约有85-90%病例是由被污染食品引发。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第12页1996年至1999年，因单核增生李斯特氏菌回收食品种类（起源：USDA及FDA汇报）单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第13页致病性及其治疗该病临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺点患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发烧、抽搐、昏迷、自然流产或死婴、脑膜炎、败血症直至死亡。由该菌造成脑膜炎致死率可高达70%，败血症死亡率达50%，围产期或新生儿感染死亡率超出80%，怀孕期妇女感染，母亲通常能存活下来。抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药，或与氨基糖苷类抗生素一起用药。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第14页感染人群感染剂量未知，但与该菌毒力和易感人群年纪、免疫状态相关。易感者：孕妇/胎儿—围产期和新生儿感染；接收皮质激素、抗癌剂治疗、器官移植治疗、艾滋病患者等免疫缺损者；癌症病人—尤其是白血病患者；不太常见报道—糖尿病、肝硬化、哮喘和溃疡性结肠炎患者；年纪较大人；没有免疫缺点健康人，食用污染该菌尤其是大量污染该菌食品后，也有患病危险。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第15页致病机理单增李氏菌抗原结构与毒力无关，它致病性与毒力机理以下：1、寄生物介导细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；2、抗活化巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内过氧物（为杀菌毒性游离基团）分解；3、溶血素，即李氏杆菌素O，能够从培养物上清液中取得，有α和β两种，为毒力因子。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第16页试验室危害不是一个普遍与试验室相关传染病，当前只有少数有报道案例发生；直接摄取是最普遍一个感染方式，除此之外，暴露在该菌高浓度气溶胶中，也可经过眼睛和破损皮肤、粘膜进入体内造成感染。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第17页注意事项生物安全2级，操作时应有对应防污染设施，在进行可能产生气溶胶操作时，应在生物安全柜内完成；在直接接触有感染性材料时，必须穿着试验服，戴手套和护目镜；怀孕妇女应防止接触传染物。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第18页操作要求溅洒：使气溶胶沉降，穿着防护服装，用纸巾轻轻覆盖溅洒处，加入1%次氯酸钠溶液，由周围向中心加，在清理之前要留充分接触时间（30min）；废弃：在废弃前应先采取净化办法，高压蒸汽灭菌、化学消毒、焚烧等；储存：在有适当标识密封容器内储存。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第19页检测程序

---增菌当前惯用单核增生李斯特氏菌检测增菌肉汤主要有半量Fraser肉汤、Fraser肉汤（FB）、UVM（ModifiedUniversityofVermontbroth，也叫UVM1）、LEB（Listeriaenrichmentbroth）和BLEB（bufferedListeriaenrichmentbroth）单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第20页半量Fraser肉汤和Fraser肉汤含有选择性和区分性。加入柠檬酸铁铵和七叶灵，起到区分作用。李斯特氏菌能够水解七叶灵，与培养基中铁离子反应，使培养基变黑，可直观从培养液颜色就能够判断是否有单核李斯特氏菌生长。氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。半量Fraser肉汤与Fraser肉汤所用添加剂一样半量Fraser肉汤：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黄12.5mg/LFraser肉汤：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黄25mg/L单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第21页UVMUVM只有选择性没有区分性加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄，作为选择性因子。即使其中含有七叶灵，不过没有添加柠檬酸铁铵，不能发生黑色颜色反应。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第22页LEB和BLEB只有选择性没有区分性LEB是在TSB-YE基础上加入盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入丙酮酸钠，有利于受损细胞恢复；不含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应BLEB是在LEB基础上加入缓冲体系：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第23页检测程序

---分离分离培养基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首选依然是OXA。分离原理主要是基于李斯特氏菌含有β－D－葡萄糖苷酶活性，能水解培养基中七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反应还有一些选择性显色培养基，如BCM、ALOA、CHROMagarlisteria、Rapid’L.mono等，其原理主要是检测由毒力基因编码溶血素，而此种溶血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而能够很好将此两种菌同李斯特属其它种分开。单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第24页OXA平板单核增生李斯特氏菌ATCC1911748h，35℃培养单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第25页OXA平板无害李斯特氏菌ATCC3309048h，35℃培养单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第26页检测程序

---判定蓝色菌落检验（Henryillumination）经典运动：相差显微镜，轻微旋转或翻跟头动力试验：7天，伞形生长过氧化氢酶试验：阳性革兰氏染色：阳性短杆菌溶血试验：穿刺接种血平板硝酸盐还原试验：5天，阴性糖发酵试验：葡萄糖、麦芽糖和七叶灵，李斯特菌属反应均为阳性，除格氏李斯特甘露醇阴性，李斯特其它种甘露醇阴性，木糖和鼠李糖最有检测意义单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第27页动力试验单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第28页血平板单核增生李斯特氏菌ATCC1911736h，35℃培养单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第29页血平板无害李斯特氏菌ATCC3309036h，35℃培养单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第30页血平板伊氏李斯特氏菌ATCC1911924h，35℃培养单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第31页单核增生李斯特氏菌检测流程25g样品+225mlBLEB基础（加入丙酮酸钠）

加入萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌酮30℃4hr划线接种OXA平板30℃

24hr和48hr

科玛嘉李氏菌显色培养基TSA-YE分纯35℃

24hr-48hr

35℃

24hr过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发酵试验（木糖、鼠李糖）APIListeria35℃

24-48hr汇报结果35℃18-24hr单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第32页方法名称一次增菌二次增菌分离判定快速方法SN0184-1993加工MBP30℃，18-24hEB30℃，24/48hMMA/OXA（35℃，24-48h）蓝色菌落；经典运动；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验；硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖发酵；动力试验；协同溶血*；血清学检验*；小鼠毒力试验*无未加工EB（30℃，24/48h）GB/T4789.30-EB（30±1℃，48h）MMA（30±1℃，24-48h）蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色镜检（革兰氏染色、经典运动）；生化特征（溶血反应、硝酸盐还原、尿素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力试验；协同溶血无LB1（30±1℃，24h）LB2（30±1℃，24h）FDABLEB+Phy（30℃，4h）BLEB+Phy+三种抑菌剂（30℃，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七叶灵+Fe3+推荐BCM/ALOA/RapidL'mono/CHROMagarListeria蓝色菌落*；经典运动或动力试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验；硝酸盐还原*；糖发酵；协同溶血；血清学检验；小鼠毒力试验*筛选、判定都能够使用快速方法USDAUVM（30±2℃，22±2h）FB（35±2℃，26-48±2h）MOX（35±2℃，26-48±2h）初步判定：纯菌菌落形态；经典运动；生化判定：MICRO-ID®Listeria或Api®Listeria或BAM等方法中传统生化反应；协同溶血遗传判定：核糖体RNA检测；PFGE*筛选取快速方法必须经过确认后才可使用判定中用到MICRO-ID®、Api®、GenProbeAccuProbe®、GENE-TRAK®各官方方法比较单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第33页各官方方法比较方法名称一次增菌二次增菌分离判定快速方法CFIAMFHPB-30LEB（UVM）（30℃，24/48h）MFB（35℃，24-48h）OXA+LPM或MOX或PALCOM经典运动或动力试验；溶血试验；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速判定试剂盒*；过氧化氢酶*；革兰氏染色*；协同溶血*；血清学试验*作为判定可选步骤，允许使用快速方法，如Vitek或API、MicroIDListeria、ListeraAccuprobe™ISO11290-1:1996（E）半量Fraser肉汤（30℃，24±2h）Fraser肉汤（35或37℃，48±2h）OXA和PALCOM（30、35或37℃，24-48h，）PALCOM平板微需氧或好氧条件培养蓝色菌落*；过氧化氢酶；革兰氏染色；动力试验或经典运动*；溶血试验；糖发酵试验；协同溶血；送参考试验室（血清或噬菌体分型）无NMKLNo.1362nd1999LBⅠ（30.0±1.0℃，24±3h）LBⅡ（30.0±1.0℃，24±3h）或Fraser肉汤（37.0±1.0℃，48±4h）OXA和PALCOM（37.0±1.0℃，24±3/48±4h，好氧或微需氧）溶血试验；过氧化氢酶；革兰氏染色；经典运动动力试验；糖发酵试验；送参考试验室（血清、噬菌体、DNA或酶分型）允许使用经过确认商业化生产单核增生李斯特氏菌菌株判定试验，但没列明详细试剂盒名称单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第34页红肉、禽、蛋和环境样品中分离和判定单核增生李斯特氏菌方法单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第35页红肉、禽、蛋和环境样品中分离和判定单核增生李斯特氏菌方法单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第36页FDA：李斯特氏菌属快速筛选试剂盒Table2.

ListeriaGenusDetectionTestKitsPrescribedforRegulatoryScreeningAOACOfficialMethod993.09..Listeriaindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricdeoxyribonucleicacidhybridizationmethod(GENE-TRAKListeriaAssay).(3,14)AOACOfficialMethod994.03..Listeriamonocytogenesindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricmonoclonalenzyme-linkedimmunosorbentassaymethod(ListeriaTek).(5,15,32)AOACOfficialMethod995.22..Listeriainfoods.Colorimetricpolyclonalenzymeimmunoassayscreeningmethod(TECRAListeriaVisualImmunoassay[TLVIA]).(6,30)AOACOfficialMethod996.14..Assurance(PolyclonalEnzymeImmunoassayMethod).(7,21)AOACOfficialMethod997.03..VisualImmunoprecipitateAssay(VIP).(8,22)AOACOfficialMethod999.06..EnzymeLinkedImmunofluorescentAssay(ELFA)VIDASLISAssayScreeningMethod.(9,23)单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第37页FDA：生化判定替换方法VitekAutomicrobicGramPositiveandGramNegativeIdentificationcards(bioMerieux,Hazelwood,MO)APIListeria(bioMerieux,Marcy-l'Etoile,France)whichdoesnotrequireanadditionalCAMPtestTheMICRO-IDTMkit(bioMerieux,Hazelwood,MO;1,24)permitsspeciationofListeriaisolatesiftheirCAMPreactionsareknownThePhenotypeMicroArrayforListeria(BiOLOG,Hayward,CA)isanotherrecentlyintroducedkit.单核增生李斯特氏菌检测概述中加动物健康推广服务项目第38页FDA：判定单核增生李斯特氏菌试剂盒Table3.TestKitsUsefulinConfirmingListeriaIsolatesasListeria