动物细胞培养技术课件

第十二章动物细胞培养技术动物细胞与组织培养：指的是从动物组织或细胞从体内取出，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。细胞培养：

培养物是单个细胞和细胞群。第一节体外培养动物细胞的生物学特性一、体外培养物的细胞生物学特点（一）动物细胞特点①动物细胞大，无细胞壁②动物细胞生长缓慢，倍增时间长，易受污染③需氧量少，对机械搅拌或剪切力敏感④动物细胞间主要以聚集体形式存在⑤原代细胞一般繁殖50代即退化死亡二、体外培养细胞的形态（一）体外培养细胞的分类体外细胞生长贴附型悬浮型多形型细胞（神经元和神经胶质细胞，呈多角形）上皮细胞型（上皮、肝、胰和肺泡上皮等，源于外胚层和内胚层细胞）成纤维细胞型（心肌、平滑肌、血管内皮等，源于中胚层细胞）游走细胞型（单核细胞、巨噬细胞和某些肿瘤细胞，形状不定）（生长时不贴壁，如淋巴细胞、白细胞和某些肿瘤细胞）（二）培养细胞的生长特点体外细胞生长特点贴壁接触抑制密度抑制2）接触抑制定义：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。3）密度抑制细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，数量仍在增多，但当细胞密度进一步增大时，培养液中营养成分的减少，细胞营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。三、培养细胞的增殖能力（一）培养细胞生命期细胞周期可分为G1期、S期、G2期和M期。培养细胞单个细胞的生长过程与体内细胞单个细胞的生长过程相似。1.原代培养（PrimaryCulture）期：

也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。2．传代期

初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。

（二）每代细胞的生长过程细胞培养过程中一代指的是从细胞接种到分离再培养的一段时间。在细胞一代中细胞倍增3～6次。时期：潜伏期；对数生长期；稳定（停滞）期；衰亡期。每代细胞生长曲线每代细胞生长过程潜伏期指数生长期停滞期细胞接种后，先进入生长缓慢的滞留阶段，胞体均呈圆球形悬浮于培养液中，接着细胞开始附着于支持物表面。细胞贴壁后，逐渐伸展，恢复细胞原有形态，经过一个潜伏期，才进入生长和增殖期。

又称对数期。此期为细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多，成倍增长，活力最佳。

又称平台期，此时细胞数量饱和，细胞不再增殖，但仍有代谢活动。

细胞培养的一般过程：取材、培养及细胞冻存与复苏。第二节动物细胞体外培养技术鼠胚组织取材1.原代细胞的取材鼠肾（或肺）取材组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。1）悬浮细胞的分离方法2.原代细胞的分离特点:简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。机械分散法胰蛋白酶分散原理：主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开。酶消化分离法胰蛋白酶胶原酶胰蛋白酶消化分离法2）分散细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。3）悬浮细胞培养法（二）传代培养贴壁生长的细胞消化法传代直接吹打或用硅胶软刮悬浮细胞直接吹打自然沉降法传代培养方法（1）贴壁细胞的消化传代方法（2）悬浮细胞传代方法直接传代让悬浮细胞自然沉降弃掉1/2-1/3上清用吸管轻轻吹打制备成细胞悬液分装培养离心法传代将培养液转移到离心管中离心收集细胞弃去上清加新的培养液吸管吹打制备成细胞悬液分装培养体外培养的细胞源于人或动物的胚胎组织，体内的细胞都是混杂生长，来源于上述组织的培养材料的原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，既有上皮样细胞又有纤维样细胞，混杂的细胞会直接影响实验结果。

（三）细胞纯化

1.自然纯化

自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长，留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。

2.人工纯化人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。（1）酶消化法

酶消化法是比较常用的纯化方法，对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞先脱壁。（2）机械刮除法

原代培养时，如果上皮细胞和成纤维细胞分为区成混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。可用硅橡胶刮子去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。这样反复多次可以纯化细胞。

（3）反复贴壁法

成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞能在短时间内（大约10-30min）完成附着过程。上皮细胞（大部分）在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。

（四）细胞的冻存和复苏细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞遗传性状的改变和延缓衰老。目前，动物细胞一般保存于液氮中（-196℃）。一般在原代或传代2-10次内即大量冻存，作为原种。在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。原理：1.常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点。2.提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤。冷冻保护剂的应用冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶。慢冻程序标准程序：

当温度在-25℃以上时，1～2℃/min

当温度达-25℃以下时，5～10℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中-196℃液氮罐普通冰箱低温冰箱解冻程序原则：快速解冻原因：解冻缓慢时，原有冰晶溶化后，又会以新的晶核为中心形成更大的冰晶，称为水的重结晶现象。但采用快速解冻可避免水分的重结晶减少冰晶损伤。解冻程序：从液氮中取出冷冻管，快速放入37℃-

40℃水浴中，轻轻震摇，使冻存细胞尽快解冻（40-60s).

二、动物细胞培养的基本方法悬滴培养培养瓶培养旋转管培养克隆培养法细胞同步化培养法动物细胞的大规模培养常用的培养技术单盖玻片①将培养液滴于盖玻片上并铺展开②将待培养的组织块铺展于培养液中央③将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封④贴壁24小时内，细胞就能从组织块四周游走

（一）悬滴培养法（二）培养瓶培养法组织块的接种与培养分离细胞的接种与培养（三）旋转管培养法由于旋转作用，组织块和细胞交替地与培养基和空气直接接触。（四）克隆培养法克隆培养法又称单细胞分离培养法，将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。（五）灌注小室培养法（六）培养板培养法

具体做法是将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。最常用的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后者最为常用。一般都是一次性使用。

三、动物细胞大规模培养技术

（一）动物细胞大规模培养的方法１．转瓶培养２．反应器贴壁培养细胞贴附于固定的表面生长，不会随搅拌而随培养液一起流动，比较容易更换培养液，不需要特殊的分离和培养设备。将动物培养材料分散成细胞悬浮液\过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。传代时按比例稀释即可继续培养。３．悬浮培养４．固定化培养１）微载体法微载体是直径60-250um的微珠。一般有天然的葡聚糖或者合成的聚合物组成，如聚苯乙烯微载体、聚甲基丙稀酸羟乙酯微载体等。扩大细胞附着面，提高生长速率和产量。（1）微载体培养系统２）多孔载体法多用明胶制成。优点：降低血清用量，增加细胞固定性。大的生长空间，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，强化传质。多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞的固定化培养。（２）中空纤维培养系统最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也可在上面贴附生长。（３）微囊培养系统微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可自由透过，大分子物质可包裹在其中不能逸出。微囊化培养是将细胞包裹在微囊中，在培养液中悬浮培养。细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护，减少了搅拌对细胞产生的剪切力。细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，滴入氯化钙溶液，再用聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺溶液处理，形成半透膜。按培养细胞的方式不同，反应器可分为以下三类：

1.悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中空纤维反应器、气升式反应器；

2.贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反应器；3.包埋培养用反应器：如流化床反应器、填充床反应器。

（二）动物细胞大规模培养用生物反应器种类一、培养细胞的生物学鉴定和细胞系（株）的建立（一）细胞形态观察１．肉眼观察培养物颜色及混浊度２．倒置显微镜观察细胞生长状态第三节培养细胞常规检查和特性鉴定细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，以培养时间（d）为横坐标、细胞密度为纵坐标所做出的曲线。（二）细胞生长情况1.细胞生长曲线的测定（1）细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，用以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。●MTT是二甲基噻唑二苯基四唑溴盐，四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。●MTT比色法的原理：活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。●二甲亚砜能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的蓝紫色产物量成正比。再用酶标仪测定OD值。(2)MTT比色法MTT法+DMSO操作步骤：接种细胞于96孔培养板（103-104细胞200微升/孔）37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）继续培养3小时吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔）振荡10分钟酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）记录结果，绘制细胞生长曲线(3)CCK-8法（CellCountingKit-8）原理：试剂中含有WST-8【2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基）-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体【1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲脂】(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料。甲瓒染料的数量与活细胞数量成正比，因此可以根据测定吸光度值来测定增值细胞和活细胞数。96孔板接种培养一定时间的细胞（100μl/孔）继续培养2-4小时加CCK-810μl/孔测吸光度CCK-8法

96孔板比色分析

为1瓶溶液，即开即用

对细胞毒性小毋需有机溶剂

灵敏度高CellCountingKit-8优点2.细胞分裂指数细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般计数1000个细胞中的细胞分裂指数。公式：3.

细胞贴壁率细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力，和部分底物材料的相容性。4.细胞周期细胞周期是指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一次再分裂结束形成两个子细胞的时间，仅指一个细胞的分裂生长周期时间。5.细胞活力检测由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排除，因而细胞显示一定的颜色。而活细胞由于能排除进入细胞内的染料，故不易着色。台盼蓝排斥试验计数1000个细胞中的活细胞（不着色）和死细胞（染上蓝色）数目。计算活细胞百分比。trypanblue溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法溴化乙锭（EB）和碘化丙锭（PI）均为荧光染料，可与DNA特异结合。

Photomicrographs

EthidiumBromide荧光染色与计数：取细胞悬液和EB或PI染液各0.5ml，混匀。静置10～30min后于荧光显微镜下计数。发橙红色荧光者为死细胞。二、培养细胞的常规检查（一）培养液和pH鉴定（二）细胞生长情况分析（三）培养细胞的污染监测和排除培养细胞污染微生物真菌细菌支原体病毒化学物质（非细胞生长所需化学成分）细胞（非同种的其他细胞）常见的污染及检测方法(1)细菌的污染及检测常见细菌污染革兰氏阴性菌（白色葡萄菌）E.coli假单胞菌检测方法显微镜观察法（在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染）肉眼直接观察法（培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起）培养检查法（采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，若被污染24小时内可获得阳性结果）(2)真菌的污染及检测常见真菌污染检测方法烟曲菌、黑曲菌