流式细胞仪培训

流式细胞仪原理与应用陈玉婵流式细胞仪培训第1页提要流式细胞仪介绍流式细胞仪工作原理流式试验流程流式细胞术应用流式细胞仪培训第2页流式细胞术发展史1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞计数，是经过光电仪统计流过一根毛细管细胞,用结合了荧光素抗体去标识细胞内特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器。）1960s晚期发展：荧光检测细胞计、细胞分选器检测细胞荧光信号、单克隆抗体技术1973年，BD企业与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACSI。流式细胞仪培训第3页什么是流式细胞仪？在流动状态中检测细胞各种物理及生物特征一个仪器仪器特点：单个细胞经过狭窄激光束，产生能够反应细胞大小信号，激光束激发不一样荧光素所标识细胞成份能发射出不一样荧光。InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式细胞仪培训第4页流式细胞仪检测对象藻类细胞染色体血细胞原生动物细胞任何存在于悬液中直径为0.2-50微米粒子或细胞都适合用于流式分析流式细胞仪培训第5页流式细胞仪工作原理示意图流式基本组成：1.流动室和液流系统2.光路系统3.电系统流式细胞仪培训第6页流式细胞仪可提供信息物理信息：经过散射光信号反应相对细胞大小相对细胞颗粒密度和内部复杂度荧光信息：经过荧光强度反应

流式细胞仪培训第7页散射光信号产生488nm激光产生散射光流式细胞仪培训第8页1.散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光同向散射光信号反应细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）入射激光90角散射光信号

反应细胞粒度及细胞内相对复杂性

流式细胞仪培训第9页散射光散射光能被用来区分不一样细胞群体基本形态上差异通常使用“散点图”来看散射光信号散点图上一个点就代表一个细胞颗粒数据

流式细胞仪培训第10页利用散射光信号对混合细胞分群流式细胞仪培训第11页2.荧光信号荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生荧光信号越强流式细胞仪培训第12页荧光信号表示方法双参数点图单参数直方图流式细胞仪培训第13页一个完整流式试验组成样品处理调整仪器条件数据处理流式细胞仪培训第14页1.样品处理单细胞悬液制备浓度51051106/mL外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤)制成单细胞悬液选择适当荧光染料染色必须能够被流式细胞仪上所配置激光器所激发激发光谱必须在仪器上滤光片能够接收适当范围内荧光素光谱重合应该尽可能降低流式细胞仪培训第15页2.仪器条件确实定电压阈值荧光赔偿（多色分析）流式细胞仪培训第16页处于液流中粒子经过激光束时产生光信号，这些光信号经过光电探测器转换成电信号（电压）。调整电压，可使信号强度改变。BD流式细胞仪有两种类型光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。PMT用于检测较弱SSC信号和荧光信号，光电二极管用于检测较强FSC信号电压流式细胞仪培训第17页阈值阈值：信号放大过程会产生不需要脉冲信号，通常来自于碎片。经过设定某一信号最低强度值，可将不需要脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。流式细胞仪培训第18页荧光赔偿采取适当方法校正荧光染料之间叠加所造成误差流式细胞仪培训第19页荧光赔偿流式细胞仪培训第20页赔偿调整试验过程样本准备：阴性样本，单阳性样本调整：第一步：阴性样本调整全部PMT第二步：单阳性样本调整赔偿判断标准：流式细胞仪培训第21页赔偿模型PE-X%FITC赔偿前赔偿后FITC单染流式细胞仪培训第22页数据分析设门设定阴性与阳性群体界限确定阳性与阴性细胞群体统计阳性或阴性细胞群体百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数流式细胞仪培训第23页设门设门意义：选定要分析目标细胞流式细胞仪培训第24页设门流式细胞仪培训第25页怎样设定阴性与阳性界限流式细胞仪培训第26页流式检测结果表示方法百分率绝对计数平均荧光强度图形：直方图、散点图流式细胞仪培训第27页流式细胞仪能够告诉我们什么？流式细胞仪培训第28页流式细胞术细胞学应用细胞结构细胞大小细胞流式细胞术细胞学应用粒度细胞表面面积核浆百分比DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析细胞功效细胞表面/胞浆/核特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡流式细胞仪培训第29页流式细胞仪在微生物研究中应用DNA蛋白过氧化物生成胞内pH判别死/活细菌和酵母菌并计数区分革兰氏阳/阴性细菌研究酵母菌细胞器基因表示-绿色荧光蛋白病原菌与吞噬细胞关系-吞噬引发呼吸暴发病毒-细胞相互作用：病毒感染造成细胞蛋白表示改变，对细胞周期干扰，对细胞内钙离子水平影响病毒引发凋亡流式细胞仪培训第30页流式细胞仪临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤免疫分型肿瘤细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检验HLA-B27检验血小板功效及相关疾病流式细胞仪培训第31页赔偿调整试验流式细胞仪培训第32页藻类细胞绝对计数流式细胞仪培训第33页细胞周期分析DNA含量分析-PI染色流式细胞仪培训第34页流式细胞仪培训第35页细胞凋亡细胞膜分析-PS外翻PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合流式细胞仪培训第36页细胞凋亡流式细胞仪培训第37页细胞生理学研究Ca2+流动性检测Ca2+是非常主要细胞内离子，在胞膜到胞浆信号转导中起主要作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。最惯用染料Indo-1excitedatUVFluo-3excitedat488nmFuraredexcitedat488nm流式细胞仪培训第38页细胞生理学研究细胞活性分析

FluoresceinDiacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光流式细胞仪培训第39页细胞生理学研究细胞膜电位改变超极化细胞摄取更多染料，细胞总荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总荧光强度降低。染料和试剂DiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)Valinomycin