§3-1酶工程概述课件

§3酶工程河南工业贸易职业学院粮食与生物工程系本章主要内容§3-1酶工程概述一、酶的基本概念、分类和命名二、酶工程的概念、内容、研究进展§3-2酶工程的内容一、食品酶的生产与分离纯化二、酶的改造与修饰三、酶的固定化四、酶反应器本章主要内容§3-3酶工程在食品工业中的应用一、酶工程与食品加工二、酶工程与食品添加剂三、酶工程与功能性食品配料四、酶工程与食品原料改良一、酶的基本概念、分类和命名1、酶的概念2、酶的催化特性3、酶的分类4、酶的命名1、酶的概念酶：来自于生物细胞的具有催化功能的特殊蛋白质，其催化具有高效性、专一性，而且反应条件温和，反应产物易纯化酶是生命活动的推动机2、酶的催化特性催化效率高专一性高反应条件温和活性可调节其催化活性离不开辅酶、辅基以及金属离子的作用2H2O22H2O+O21mol过氧化氢酶5×106molH2O21mol离子铁6×10-4molH2O23、酶的分类氧化还原酶转移酶水解酶裂合酶异构酶连接酶或合成酶表3-14、酶的命名习惯命名法系统命名法二、酶工程的基本概念、内容和研究进展1、酶工程的概念2、酶工程的内容3、酶工程发展简史1、酶工程的概念酶工程：指酶的生产和应用过程酶的生物合成法生产酶的分离纯化酶分子修饰酶和细胞固定化酶的非水相催化酶反应器酶在医药、食品、轻工、化工、环保、能源领域的应用2、酶工程的构成生物酶工程（高级酶工程）克隆酶、突变酶、新酶化学酶工程（初级酶工程）指自然酶，化学修饰酶，固定化酶，化学人工酶3、酶工程发展简史1894年，日本高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶，用作消化剂。1898年，德国的罗姆Rohm制得胰酶，用于皮革软化。1908年法国Boidin制备得细菌淀粉酶，用于纺织品退浆1911年，美国的华勒斯坦（Wallerstein）制得木瓜蛋白酶，用来去除啤酒中的蛋白质浑浊。原料来源、分离纯化技术限制，将近半个世纪都停留在从动物、植物、微生物细胞中提取酶并应用1949年，用微生物液体深层培养法进行细菌α－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕。20世纪50年代开始：从微生物发酵液中分离出一些酶，制成酶制剂。许多酶制剂开始使用微生物发酵方法生产工业化生产开始20世纪80年代植物细胞培养：SOD、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、过氧化物酶、糖苷酶、糖化酶等动物细胞培养：胶原酶、血纤维蛋白溶酶原活化剂动植物细胞培养技术成为酶生产又一途径酶生产发展，应用也越来越广泛独特优势：专一性强、催化效率高、作用条件温和等应用拓宽：医药、食品、化工、能源、环保和科研等领域大多数酶不能耐高温、强酸、强碱、有机溶剂等作用，稳定性差酶通常在水溶液中与底物作用，只能作用一次酶在反应液中与反应产物混在一起，产品分离纯化时较困难工业化、细胞培养应用中存在的问题无意的发现：

1916，美国奈尔森和格里芬将蔗糖酶吸附在骨炭上，该酶仍具催化活性目标明确的开发：1953，德国的格鲁布霍费和施米斯首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶等结合其上，制成固定化酶20世纪60年代，固定化技术迅速发展1969，日本千畑一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶进行D、L氨基酸拆分，而生产L氨基酸1971，在美国举行了第一届国际酶工程学术会议，会议的主题是固定化酶固定化酶技术的发展固定化酶的优势和不足

优势：提高稳定性，可以反复使用或连续使用较长的一段时间按，易于与产物分离等

不足：固定化技术较为繁杂，而且用于固定化的酶要首先经过分离纯化1973，日本成功地利用固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸固定化酶技术→固定化菌体死细胞或静止细胞1978，日本铃木等人用固定化细胞生产α-淀粉酶研究成功之后，相继用于生产蛋白酶、糖化酶、果胶酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等固定化细胞的优势与不足

优势：

固定化细胞可反复或连续用于酶的发酵生产，有利于提高酶的产率缩短发酵周期

不足：但固定化细胞只能用于生产胞外酶等容易分泌到细胞外的产物固定化酶、菌体技术→固定化细胞活细胞或增殖细胞原生质体

解除了细胞壁这个扩散障碍有助实现胞内酶的连续生产胞内酶的原生质体固定化技术酶的化学本质结构与功能通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能酶分子修饰方法主要有酶分子主链修饰酶分子侧链基团修饰酶分子组成单位置换修饰酶分子中金属离子置换修饰等酶的分子修饰修饰酶：水溶性固定化酶：水不溶性共同目的：提高酶活力，增加酶稳定性消除或降低酶的抗原性等修饰酶和固定化酶蛋白质工程，20世纪80年代中期发展起来的蛋白质工程将酶分子修饰与基因工程技术结合在一起蛋白质工程：通过定位突变技术，把酶分子修饰后的信息储存于DNA之中，经过基因克隆和表达，就可通过生物合成的方法，不断获得新的特性和功能的酶，使酶分子修饰的应用前景更广阔蛋白质工程与酶分子修饰

60年代后：固定化酶，固定化细胞的崛起。

70年代后期：微生物学，遗传工程，细胞工程的应用技术面貌一新。已发现和鉴定的酶有8000多种，大规模运用商品酶只有数十种（16种），小批量生产的有百来种。

自然酶在工业应用上受限制的原因有：（1）多数酶脱离其生理环境后极不稳定，在生产和应用过程中的条件与其生理环境相去甚远（2）酶的分离纯化工艺复杂（3）酶制剂成本高§3-2酶工程的内容一、食品酶的生产与分离纯化二、酶的改造与修饰三、酶的固定化四、酶反应器一、食品酶的生产与分离纯化1、酶的生产方法2、微生物发酵产酶3、酶的提取与分离纯化4、酶的浓缩、干燥和结晶1、酶的生产方法提取分离法动植物器官、组织、细胞和微生物细胞中酶的提取；最早采用；也是其他生产方法中的技术环节生物合成法利用微生物、动植物细胞的生命活动获得所需酶化学合成法人工合成酶，局限于实验室的技术，成本高动物胰脏——胰酶木瓜——木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶菠萝皮——菠萝蛋白酶提取分离法其他生产方法不可或缺的技术环节设备简单，操作方便但原料来源受限，优良产酶细胞筛选→生物反应器中细胞培养→生产各种代谢产物→分离纯化→酶产品微生物细胞产酶——发酵法动植物细胞培养产酶

大蒜细胞培养→SOD

木瓜细胞培养→木瓜蛋白酶等生物合成法生产周期短，产率高2、微生物发酵产酶酶生产的发酵方法产酶细胞的要求酶发酵生产常用的微生物酶生产的主要发酵方法液体深层发酵技术枯草杆菌→淀粉酶、蛋白酶大肠杆菌→谷氨酸脱羧酶、多核苷酸聚合酶黑曲霉→糖化酶、果胶酶固定化细胞发酵→胞外酶固定化原生质体发酵→胞内酶酶制剂的生产:

提取法生产方法发酵法化学合成法

提取和分离纯化

酶的固定化

总结：目前工业上大多采用微生物发酵法来获得大量的酶制剂。此法的优点在于微生物不受气候、地理等条件的限制、繁殖速度快。还可以根据需要选育菌种来提高产酶率。

产酶细胞的要求酶的产量高容易培养和管理产酶稳定性好利于酶的分离纯化安全可靠酶发酵生产常用的微生物枯草芽孢杆菌大肠杆菌黑曲霉米曲霉青霉木霉根霉毛霉链霉菌（葡萄糖异构酶）啤酒酵母假丝酵母3、酶的提取与分离纯化微生物细胞破碎——胞内酶酶的提取常用方法酶的精制纯化常用方法酶提取过程中的注意事项酶分离纯化的一般原则抽提纯化制剂酶制剂生产三步骤酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。微生物细胞破碎——胞内酶机械破碎法高压匀浆法珠磨法超声波破碎法非机械破碎法酶溶法、化学渗透法JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。酶的提取为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。酶提取的主要方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。酶精制纯化的主要方法沉淀分离离心分离过滤与膜分离层析分离电泳分离萃取分离沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离的主要方法

盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件离心分离——认识几种离心机常速离心机又称为低速离心机其最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g以下在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机最大转速为（1～2.5）×104r/min

，相对离心力达到1×104～1×105g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。超速离心机最大转速达(2.5～12)×104r/min，相对离心力可以高达5×105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。过滤分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜层析分离方法层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：

纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳自由电泳等电聚焦电泳

4酶的浓缩、干