《基因工程》-考试重点总结

《基因工程》一一考试重点总结

第一章基因工程概述

第一节基因操作与基

因工程

基因操作(genemanipulation)：指对基因进行分离、

分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。

基因工程(geneengineering)：通过工具酶，在体外

将目的基因、基因片段或其它DNA元件进行切割，

与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞,

并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性

状或获得表达产物。

基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因

重组(generecombination)技术，基因工程是基因

操作、基因重组的核心内容和主要目的。

基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗

传性状的变化并能稳定遗传给下一代。

第二节基因工程是生物科学发展的必

然产物

一、基因是基因重组的物质基础

遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。从物质结

构上看，基因是染色体组核酸分子。基因(gene)是

作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传

学功能，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是

DNA也可以是RNA,可以存在于染色体上，也可存

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在于染色体之外(如质粒、噬菌体等)。

基因工程的理论基础：

⑴.明确了遗传信息的携带者一基因的载体是DNA,

明确了遗传的物质基础。

(2).DNA分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以

阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。

⑶.中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的

破译，解决了遗传信息的流向和表达问题。

(4).遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因

工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现

跨越任何物种界限的遗传成分转移。

自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实

基因工程的技术基础：

(1).DNA体外切割和连接技术(限制性内切核酸酶和

DNA连接酶的发现与应用，标志着DNA重组时代的

开始)。

⑵.克隆载体的发展与应用。

⑶.大肠杆菌转化体系的建立。

(4).琼脂糖电泳技术的应用。

(5).DNA测序技术的应用。

(6).核酸杂交技术的应用。

从技术上为基因工程的诞生奠定了基础。

四、基因工程的内容

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1、基因操作原理：

(1)DNA和RNA的操作。

(2)基因克隆与功能研究。

(3)基因组学与生物信息学的应用。

2、基因工程的应用：

(1)生物反应器(bioreactor)：大规模生产生物活

性分子如生长激素、胰岛素等。

(2)遗传改良(geneticimprovement)＞分子育种

(molecularbreeding)＞设计构建新物种。

(3)基因治疗(genetherapy)：人体转基因或基因

组编辑。

第三节基因的结构一一基因操

作的理论基础

一、基因的结构组成对基因操作的影响

1、基因及其产物的共线性：一个基因的核昔酸序列

与其产物的氨基酸序列一一对应。

N个氨基酸=3N个编码碱基。

2、基因及其产物的非共线性。间断基因。

内含子(intron)是指真核基因在RNA加工过

程中从原初转录本中剪去而不进入成熟RNA结构、

不具有氨基酸编码能力的一段序列。

外显子(exon)：是真核基因转录本中剪去内含

子后所保留的RNA片段，它们拼接并进行适当修饰

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后成为成熟RNA并执行相应功能。

3、基因的重叠性与可变性：

基因的重叠性：单个DNA序列可编码一个以上的蛋

白质，它们在结构上可以具有序列重复性，也可以是

相互完全不同的全新蛋白质。

原因：可变性转录起始位点、可变性起始位密码子、

可变性编码终止位点、可变性剪接。

开放读码框(openreadingframe,ORF)：成熟mRNA

中从起始密码子ATG至终止密码子(TAA、TAG或

TGA之一)之间形成的一个连续的氨基酸编码区间。

以起始密码子的第1个碱基作为+1,其5,方向的第

1个碱基为-1。

4、启动子和终止子

启动子(promoter)：基因转录过程中控制起始的部

位，通常是位于转录起始位点5,上游的一段DNA

区间，其上有许多顺式元件。

转录起始位点(transcriptionstartsite)：起始转录的

第一个碱基，也是掺入到RNA中的第1个碱基。在

转录研究中记为+L其5,方向的第1个碱基(已属

于启动子而非转录区)为-1。

侧翼序列(flankingsequence)：一条核酸单链上位

于某一特定位置的5,或3,方向的序列。

上游(upstream)：一条核酸单链上位于某一碱基的

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5'方向。

下游(downstream)：一条核酸单链上位于某一碱基

的3,方向。

终止子(terminator)：位于基因的3'部位、终止基

因转录过程的一段DNA区间。有依赖不依赖P因子

两种。

核糖体结合位点(ribosomalbindingsite,RBS)：位

于mRNA起始密码子及其正上游的一段区间，是核

糖体结合并起始翻译过程的位点。原核和真核的RBS

显著不同。

转录单位(transcriptionunit)/转录本(transcript)：

从转录起始位点直至转录的最后一个碱基之间被转

录的RNA序列，可以包含一或多个蛋白编码框。

亚克隆(subcloning)：

1、将大片段克隆子的DNA重新打断成小片段，然

后分别克隆到新的载体中，供进一步研究。

初步克隆中的外源片段往往较长,含有许多目的基因

片段以外的DNA片段，在诸如表达序列分析和突变

等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一

小段DNA找出来，这个过程叫“亚克隆”。

2、通指将DNA片段从一个载体穿梭克隆到另一个

载体的过程。

亚克隆技术：泛指实验室中以DNA在大肠杆菌中经

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典克隆操作为核心的基本技术体系。

第二章分子克隆工具酶

第一节限制

性内切酶

一、限制与修饰

1、限制与修饰现象：

限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制性

内切酶(restrictionednonuclease)的作用，破坏入

侵的噬菌体DNA,导致噬菌体的寄主范围受到限制。

限制作用实际就是限制性内切酶降解外源

DNA,维护宿主遗传稳定的保护机制。

修饰(mod击cation)：指寄主本身的DNA,由于在合

成后通过甲基化酶(methylase)的作用得以甲基化,

使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。

修饰作用宿主细胞通过甲基化作用达到识别自

身遗传物质和外来遗传物质的目的。

甲基化作用：最主要的碱基修饰，使腺嗯吟A成为

N6.甲基腺噤吟，胞嗑咤成为5,-甲基胞噫咤。

限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定

核甘酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解

酶。

限制酶存在于细菌中，也存在于一些病毒中，真核生

物中没有限制酶。

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3.限制性核酸内切酶的种类

据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是

否具有修饰酶活性，可分为I、n、m型三大类。

n型限制酶用途大，多为同源二聚体，其中切口酶只

在单链上产生切口，Ils型识别序列和切割位置特殊。

二、限制酶识别的序列

1、限制酶识别序列的长度(!>)：一般为4・8个碱基对,

最常见为6bp。识别位点出现频率：4n

2、限制酶识别序列的结构：多数为回文结构

(palindrome)即镜像对称结构。

一些酶可识别多种结构尤其是允许一些碱基是简并

的，

还有一些酶识别序列呈间断对称，即回文对称序列之

间可以间隔一定长度的任意碱基。

3、限制酶的切割位置：多数在识别序列内部，也有

在外部、两端、两侧或单侧的。

三、II限制酶的功能和产生的末端类型

II限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以

核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的

DNA片段5,端为P,3'端为OH,识别序列一般

为4〜6个碱基对，通常是反向重复顺序，具有180°

的旋转对称性，即回文结构。

II限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的

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末端类型。

1、对称型突出末端：回文结构决定对称，分为5,

突出和3'突出的粘性末端(cohesive/stickyend)两

种。

2、平末端(bluntend)：任何平末端酶的酶切产物可

以互连，但连接效率比粘性末端低100倍左右。

3、非对称的突出末端：因为识别序列是非回文的、

简并的或存在间隔序列，故产生的粘性末端也为非对

称的。即使是单酶切限制片段在连接时也具有方向

性。

4、同裂酶(isoschizomer)：不同的酶识别序列相同,

切割位点可以相同也可以不同，又分为同序同切酶、

同序异切酶、同功多位酶和其它类型。

例：SmaI(CCCIGGG)和XmaI(CICCGGG)

5、同尾酶(isocaudarner)：不同限制酶识别序可以

相同，也可以不同，但它们产生的末端是一样的，末

端间可以相互连接。同尾酶在基因工程尤其是载体构

建中有较大用途。

例：XhoI(C!TCGAG)与SalI(GITCGAC)、

BamHI(GIGATCC)和BglII(AIGATCT)

6、归位内切酶(homingendonuclease)：一些线粒

体、叶绿体、核DNA和T偶数噬菌体的内含子编码

内切酶(称为1-prefix)或内含肽(intein)具有内切

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酶活性（称为PLprefix）。它们识别序列很长，核心

识别序列一般为1042bp,识别位点极少。

四、DNA末端长度对限制酶切割效率的影响

限制性核酸内切酶识别和切割靶序列时需要识别序

列两侧具有一定长度的DNA,否则会降低切割效率。

对侧翼长度敏感性较低的酶有EcoRI等，只要一个

侧翼碱基即保证90%的效率。

对侧翼长度敏感性高的酶有AccI、HindnLPstI

等，侧翼3个碱基以上也未必理想。

设计引物、接头等时要考虑适当长度的保护碱基，载

体构建时多克隆位点中的相临位置的酶的切割序列

的选择也很重要。

限制酶的活性单位（unit）：1个单位的酶是指在建议

的缓冲液及温度下，在20P1反应液中反应lh,使1

UgDNA（多用入）完全消化所需要的酶的量。

五、位点偏爱

某些限制酶对同一底物中的不同位置的识别位点的

切割效率不同，表现出偏爱性，这种现象称作位点偏

爱。

某些噬菌体DNA中的某些相同的酶切位点对酶的敏

感性不同。入噬菌体DNA为48502bp,两端为12bp

粘性末端。EcoRI酶切割X噬菌体中的5个位点时

并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切

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割快10倍;EcoRI对腺病毒2DNA不同位置切点的

切割速率也不同。

由于位点偏爱性，入DNA用Hindin消化而制备的

入HindlllDNAmarker中4.3kb条带甚至比2.0kb

条带还弱。

原因：切割时需要同时与2个识别位点作用(如Nar

I等)，或识别和切割时要求在DNA上有2个明显

不同的结合位点，其中1个是另1个的被切割时起激

活作用的变构位点。

应对办法：超量用酶、延长切割时间。

七、限制酶的星活性(staractivity)

在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割

与特异识别序列不同但相似的序列，降低酶切反应的

特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的

星活性。

产生原因：

①反应体系中甘油的浓度大于5%o

②酶用量过大，大于lOOU/UgDNA。

③低离子强度,小于25mmol/Lo

④高pH,大于8.0o

⑤含有机剂如乙醇、二甲基亚飒、二甲基乙酰胺等o

⑥Mn2+、Cu2+>Co2+>Zn2+等非Mg2+的二价

离子的存在。

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易发生星活性的内切酶有：EcoRKHindlll、KpnK

Pstl>Sall、Hinfl等。

办法：对因改进。

八、单链DNA的切割

多数限制酶很难切割单DNA模板。

部分限制酶除切割双链DNA外，还可切割单DNA,

但活性一般都不高。

切口酶虽然识别双链，但只在单链上切口，名称前要

加一个N。

九、酶切位点的引入

现代基因工程中通过引物化学合成等方式可以很方

便进向目标位置引入设计的酶切位点。

通过不同酶切末端的连接重组也可产生新的酶切位

点，对具体情况的分析在设计中有价值：

5,突出末端补平后重连；

同尾末端连接；

平末端连接。

十、影响限制性核酸内切酶活性的因素

①DNA样品的纯度

DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、

SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性。

可采用以下方法，提高酶活性：

加大酶的用量，lUgDNA用10U酶

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加大反应总体积

延长反应时间

②DNA样品的甲基化程度

大肠杆菌中的dam甲基化酶在5,GATC3'序列中

的腺喋吟N6位引入甲基，受其影响的酶有Bell、

Mbol等，但BamHI、BglII>Sa113Al不受影响。

大肠杆菌中的dem甲基化酶在5,CCAGG37或5,

CCTGG3'序列中的胞喀咤C5位上引入甲基，受其

影响的酶有EcoRH等，但Bgll、Kpnl不受影响。

采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA,

可防止DNA的甲基化。

十一、基因组中酶切位点分布的不均一性

在基因组中酶切位点的分布并不是均一的。

大肠杆菌中六碱基识别的酶SpeI平均60kb才出现

1次。

酵母中重复序列以外富含GC的识别序列较少。

哺乳动物基因组中CG序列只有随机概率值的1/5,

且多数发生胞喀咤甲基化，SmaI位平均约65kb才

出现1次。

果蝇和线虫中CG基序虽然少，但不发生甲基化。

限制性核酸内切酶操作的注意事项

①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液,每次操作

时应使用新的吸头去取酶,加入酶的体积应不超过总

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体积的10%,否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会

抑制酶的活性。

②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是

在加入其它试剂之后，最后加入酶。

③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减

少酶的用量。

④当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液，

若没有通用缓冲液时，只有用1种酶切完后，纯化酶

切产物，再进行下一个酶切反应。

⑤正确保存、分装和取用限制酶，抽提高质量的

DNAo

n限制性核酸内切酶的主要用途

①在特异位点上切割DNA,产生特异的限制性酶片

段。

②建立DNA分子的限制酶图谱。

③构建基因文库。

④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组。

⑤改建质粒。

第二节甲基化酶

一、甲基化酶的种类

原核生物和真核生物中存在大量的甲基化酶

(methylase),又称甲基转移酶(methyltransferase),

大肠杆菌中有3种。

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三、甲基化对限制酶切的影响

1、修饰酶切位点：敏感的酶不能切开。

2、产生新的酶切位点：为依赖于甲基化的限制酶创

造切点。

3、对基因组作图的影响:哺乳动物具有较多的m5CG

序列具有组织细胞特异性，而且一个细胞内的m5CG

甲基化不彻底，所以用m5CG甲基化敏感的限制酶

作图时具有可变性，对图的稳定性带来影响。

植物的基因组DNA的甲基化程度高，作图时也要求

选用对m5CG甲基化不敏感的限制酶。

第三节DNA聚合酶

DNA聚合酶(DNApolymerase)的主要活性是催化

DNA的合成(在具备模板、引物、dNTPs等情况下)

及其相辅的活性。

真核生物有4种DNA聚合酶：a、B、丫、线粒体

型。

原核生物有3种DNA聚合酶：I、II、III型。

二、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow

fragment)

(1)Klenow酶的基本性质：

大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得

N端三分之二的大肽段，即Klenow酶。

Klenow酶仍拥有5'-3'的DNA聚合酶活性和3'

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T'的核酸外切酶活性，但失去了5,一3,核酸

外切酶活性。

(2)Klenow酶的基本用途(可被T4DNA聚合酶代

替)：

补平由核酸内切酶产生的3,粘性凹陷末端

抹平DNA的3,粘性凸出末端

DNA片段的同位素末端标记

cDNA第二链的合成

双脱氧末端终止法测定DNA序列

三、T4DNA聚合酶(T4phageDNApolymerase)

(1)T4DNA酶的基本特性：

有3,一5，的核酸外切酶活性和5,一3的DNA聚

合酶活性。

在无dNTP时，可以从任何3,-OH端外切

一在只有一种dNTP时，外切至互补核昔酸。

一在四种dNTPs均存在时，聚合活性占主导地位。

四、T7噬菌体DNA聚合酶(T7phageDNA

polymerase)

持续合成能力最强

有3'-5'外切酶活性是Klenow酶的1000。

可代替T7噬菌体DNA聚合酶的用途。

五、耐热性的DNA聚合酶(第八章详讲)

来自噬高温细菌，如Taq、Pfu等。

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高温下具有5,一3，DNA聚合酶活性,一般在72℃

最理想。

有5,一3，外切酶活性。

具3'f5'外切酶活性者具校正(proofreading)

功能，如Pfu。否则无校正功能，如Taq。

用于PCR扩增。

反转录酶：是依赖于RNA的DNA聚合酶，以RNA

为模板聚合cDNA链，具有5,->37的DNA聚合酶

活性、5,f3'的RNA外切核酸酶活性和RNaseH

活性，但缺乏3,一5,RNA外切核酸酶活性，所以

反转录过程中无校正功能。

末端转移酶：是不依赖于模板的DNA聚合酶，催化

dNTP加于DNA分子的3'羟基端。

可产生同源多聚尾用于连接、引物退火，也可用于末

端标记。

第四节其它分子克隆工具酶

一、依赖于DNA的RNA聚合酶

依赖于DNA的RNA聚合酶ATP(DNAdependent

RNApolymerase)包括SP6噬菌体和T4噬菌体RNA

聚合酶。

活性：转录活性，无需引物，但识别特异启动子序列。

用途：体外合成RNA分子作探针等。用于表达外源

基因的mRNA,然后用于翻译蛋白。

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二、DNA连接酶(DNAligase)

DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5,-磷酸根

和3,-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能

量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作

为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP

作为能量来源。

1、T4DNA连接酶的作用机制：

①ATP+DNAligase(E)-E-AMP+PPi。

②E-AMP上的AMP转移到DNA的5,磷酸根上，

使其活化，释放出酶。

③活化的5,磷酸根与相邻的3,羟基形成3,，5,-

磷酸二酯键，并释放出AMP。

3、平头双链DNA片段的连接操作

从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创

造的粘性末端的连接属于分子内部的连接,而平头末

端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要

慢的多。

提高平头末端连接效率的方法包括：

加大连接酶用量(10倍大于粘性末端的连接)。

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。

加入10%PEG8000,促进大分子之间的有效作用。

加入单价阳离子(NaCl),最终浓度150-200mmol/L。

第三章基因工程载体

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一、基本概念

利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因

克隆(genecloning)o

克隆(clone)：作物动词时是指从单一祖先产生同一的

DNA分子群体或细胞群体的过程，作名词时指从一

个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA

分子、细胞或个体所组成的特殊群体。

基因文库(genelibrary)：由大量的含有基因组DNA

的不同DNA片段的克隆所构成的群体。

载体(vector)：在基因工程中，携带着目的基因或

DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具DNA

分子。

二、分类

按载体功能分：克隆载体、表达载体

按载体性质分：质粒载体、噬菌体载体、人工染色体

表达体系载体

宿主

原核生物表达体系质粒、噬菌体

细菌

酵母表达体系大肠杆菌•酵母菌穿梭质粒

酵母

转基因植物体系大肠杆菌•农杆菌穿梭载体(Ti质

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粒）、病毒等植株

哺乳细胞表达体系大肠杆菌-病毒穿梭载体、脂质体

等培养动物细胞

基因直接导入DNA本身（基因枪微粒轰击法、注射

法等）生殖细胞、体细胞、个体

三、基因工程载体必须具备的条件：

※（1）有复制起点

派（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别

位点

X（3）具备合适的筛选标记

派（4）具备合适的拷贝数目

（5）分子量要相对较小

（6）在细胞内稳定性要高

（7）易分离纯化

※表示载体必须具备的条件

第一节质粒载体

一、质粒（plasmid）的基本特性

Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分

子。

质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链

DNA分子。质粒DNA多呈超螺旋的共价闭合环状

DNA（covalentlyclosedcircular,cccDNA）,大小为

l-200kb,可以持续稳定地处于游离状态，但一定条

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件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随染色体复制

而复制。

编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。质粒

DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出

能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒,并在真

核细胞中表达，因此应用广泛。

1、质粒的复制：由复制子（。日，复制起始区及与

此相关的顺式作用元件）决定。质粒复制的机理请见

教材。

2、质粒的拷贝数：根据每个寄主细胞中质粒拷

贝数的多少,把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少,

为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200

个拷贝）。作为载体的质粒一般应该是松弛型的。拷

贝数是由复制起始点的类型决定的，如pMBl或

ColElo

pUC系列载体中的突变型pMBl复制子可达

500-700个拷贝。

3、质粒的不亲和性（incompatibility）：两种亲缘

关系密切的不同质粒,不能够在同一个寄主细胞系中

稳定地共存的现象。涉及细胞分裂过程中的竞争性选

择。不相容群。

4、质粒的转移性：自然条件下质粒可通过细菌

的接合（conjugation）的作用而转移到新的宿主细胞

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中。三亲杂交法。

质粒载体应具备的条件：

1有特定的复制起始子。

2有多种限制性内切酶切点，但每种切口最好

只有1个；

2有选择标记，例如抗药性标记，蓝白斑试验;

3有一定容量；

4有相当的拷贝数，即每个宿主菌可能容纳的

最多数。

二、标记基因

1、转化子标记基因：用于鉴别目的DNA的存

在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。

Ampr（氨苇青霉素抗性基因）：水解8•内酰胺

环。

Tetr（四环素抗性基因）：阻止四环素进入细胞。

Cmr（氯霉素抗性基因）：编码氯霉素乙酰转移

酶。

Kanr（卡那霉素抗性基因）：编码氨基糖昔磷酸

转移酶。

supF（琥珀突变抑制基因）：编码细菌抑制性

tRNA,可翻译UAG为酪氨酸。赭石突变（UAA）,

乳白突变（UGA）。

正向选择标记：蔗糖致死基因sacB。

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2、重组子标记基因：用于将重组子与非重子区

别开来。

a.互补(acomplementation)：人工突变使大

肠杆菌的B.半乳糖甘酶基因(lacZ)缺失N・端的第

1L41位氨基酸，而载体则携带有LacZ基因的N-端

140个氨基酸和编码区段(lacZ'),二者单独存在时

均无功能,但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能

互补，形成具有完全活性的LacZ酶。

多克隆位点(multiplecloningsite,MCS)：载体

上的一段人工设计和人工合成的DNA序列，含有多

个在该载体唯一的限制性内切酶的切点，以方便载体

与外源片段的重组。

插入失活(insretionalinactivation)：当一段足够

长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编码区

后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的

编码能力而使该基因失活。

蓝白斑筛选(white-bhiescreening)：空载体转化

子经IPTG诱导表达后，由于a-互补而形成的功能

性的LacZ蛋白，能够转化无色底物X-gal而形成深

蓝色的产物，使菌落或噬菌斑显蓝色(蓝斑)；重组载

体的转化子中，由于lacZ，基因的插入失活而不能

形成八互补，在IPTG+X-gal条件下菌落或噬菌斑

不显蓝色(白斑)；通过菌落或噬菌斑的蓝/白色差异

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而达到筛选鉴定出重组子与非重组子的目的。

三、质粒载体的种类

质粒的发展阶段

第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，

如pSClOl、ColEl>pCR、PBR313和pBR322。

第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多

克隆位点区和新的遗传标记基因。如puc系列载

体。

第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的

不同要求，如M13mp系列载体，含T3、T7、SP6

启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。

许多实用的质粒载体都是在PBR322的基础上改建

而成

含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接

头polylinkeropUC18与pUC19只是多克隆位点的

排列方向相反，其余一致。

表达载体:一般是在克隆的载体上添加和完善了用于

外源基因表达的一些基本元件，如强启动子、蛋白纯

化标签、信号肽、诱导表达元件等。如Novagen的

pET系列、Qiagen的pQE系列。

第二节人噬菌体载体

一、入噬菌体的分子生物学

入噬菌体的组成结构和用途

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噬菌体是比细菌还小得多的微生物,和病毒侵

犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是

细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是

一段DNA,结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴

上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。

入噬菌体为线性双链DNA的细菌病毒，具有互补的

12bp粘性末端，感染细菌后粘端互补成双链环状。

全长48531bp,含50多个基因。

入噬菌体基因大致分为4个区：

结构区：A〜J19个基因，编码头、尾部蛋白质为结

构区。组区att(attachment)、int(intagrate)及

xis(excission)o调控区启动子、终止子和N、CI基因。

裂解区：Q-Ro

入噬菌体可以容纳较大的目的基因o例如用置换法可

去掉长达20kb的XDNA,换入相应长度的目的基因。

基因文库构建常使用人载体。

不少先进的质粒应用人组件进行构建。

四、人载体的克隆原理和步骤

1、通过裂解过程增殖入载体。

2、载体与外源DNA的酶切。载体一般要纯化左路、

右臂，并进行去磷酸化处理。

3、外源DNA与载体的连接，形成的是多联体。

4、重组噬菌体的体外包装，需要单独制备衣壳蛋白,

26

包装过程对DNA大小有选择性。

5、包装后的噬菌体颗粒感染大肠杆菌，经过人的复

制、包装和裂解过程，重组载体得到扩增，一个人的

感染和扩增会导致它周围一圈范围内的大肠杆菌被

溶解，形成透明的溶菌圈/噬菌斑(plaque)。

6、筛选。每个噬菌斑代表了一个重组人，所有噬菌

斑的集合就为一个文库。

pfu:plaqueformingunit,噬菌斑形成单位，指每微

克包装入DNA感染大肠杆菌后形成的噬菌斑数，要

求100万以上。

第四章人工染色体载体

第一节粘粒载体

一、粘粒的结构特征和用途

粘粒实际是质粒的衍生物，是带有cos

序列的质粒。cos序列是1噬菌体DNA中将DNA包

装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。粘粒的组成包

括质粒复制起点、抗性标记、cos位点，因而能像质

粒一样转化和增殖。

它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段

DNA,克隆的最大DNA片段可达45kbo有的粘粒

载体含有两个cos位点，在某种程度上可提高使用效

率。

27

二、粘粒载体的工作原理

粘粒载体的主要工作原理类似1噬菌体

载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于1

噬菌体载体的左右臂，cos位点通过粘段退火后，再

于外源片段相间连接成多联体。当多联体与1噬菌体

包装的蛋白质混合时1噬菌体A基因蛋白的末端酶功

能将切割成两个cos位点，并将两个同方cos位点之

间的片段包装到1噬菌体颗粒中去。

允许插入片段为30-45kbo

三、粘粒克隆载体

粘粒pJB8、含双cos位点的粘粒载体、pcoslEMBL

等。

四、粘粒载体文库的扩增和贮存

噬菌体颗粒状的粘粒文库在含有几滴氯仿的SM溶

液中可以保存几周。

可以采用影印到硝酸纤维素膜上保存、挑取所有菌落

混合培养后深冷保存，等。

第二节酵母人工染色体载体

酵母人工染色体载体(yeastartificialchromosome,

YAC)：就是模拟酵母菌染色体的复制而构建的载体。

一、YAC载体的复制元件

YAC载体的复制元件是其核心组成成分，骑在酵

母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制

28

序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个

端粒。这些元件能够满足自主复制、染色体在子代细

胞间的分离及保持染色体稳定的需要。

端粒重复序列：是定位于染色体末端的一段序列，用

于保护线状DNA不被胞内的核酸酶降解，已形成稳

定的结构。

着丝粒：是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染

色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC

中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。

二、YAC载体的工作原理

YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别

是用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常

规的基因克隆。图示是pYAC4载体的遗传结构图，

当用BamHI切割成现状后，就形成了一个微型酵母

染色体，包含染色体复制的必要顺式元件。这些元件

在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配,从而决定

着个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNA片

段。

允许插入片段大小：没有限制，一般为250・1500kb。

YAC的缺点：插入片段容易出现缺失和重排现象，

YAC与酵母染色体大小相似不容易分离和纯化。

YAC的优点：酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重

复的和极端的DNA片段有更强的容忍性，文库的代

29

表性强，适合作真核染色体片段功能研究。

第三节细菌人工染色体载体

细菌人工染色体载体(bacterialartificial

chromosome,BAC)：就是基于大肠杆菌的F质粒

构建的高容量低拷贝质粒载体。

F质粒：是一个约lOOkb的质粒，编码60多种参与

复制、分配和结合过程的蛋白质。

一、BAC载体及其结构组成

BAC载体大小约7.5kb,其本质是一个质粒克隆载

体。BAC载体与常见克隆载体的核心区别在于其复

制单元的特殊性。复制单元来自F质粒

二、BAC载体工作原理

BAC载体的工作原理与常规的质粒克隆载体相似。

不同的是，BAC载体装载的是大片段DNA,一般在

100-300kbo对如此大的DNA片段一般要通过脉冲

场凝胶电泳来分离。另外，由于BAC载体的拷贝数

小，制备难度大。为解决这个问题，有的学者将BAC

载体作为外源片段克隆到常规高拷贝质粒载体上,从

而在大肠杆菌中以多拷贝的形式复制，便于载体的制

备，使用时将高拷贝质粒去掉。

第四节P1噬菌体载体和P1人工染色体载体

一、P1噬菌体的分子特征：

双链线状DNA,llOkb,末端具有10kb左右冗余序

30

列，感染进入大肠杆菌后冗余序列发生重组，形成环

状分子，cl决定进入溶原或裂解状态。

包装方式与人不同。

二、P1噬菌体载体元件：复制元件、环化和包装信

号、标记基因、克隆位点、填充片段。

P1噬菌体载体工作原理：与粘粒相似。

三、P1人工染色体载体：

结合了P1噬菌体载体和BAC载体的最佳特性，如

pCYPACl,允许外源片段为130-150kb,采用电转

化，外源片段的嵌合和重组现象较低，对重组序列的

回文结构的忍受性强。

第五章表达载体

第一节大肠杆菌表达载体

一、大肠杆菌表达载体的结构

原核表达载体:适用于在原核细胞中表达外源基因的

载体。

均是质粒载体，首先必然满足克隆载体的基本要求,

然后增加表达元件。

1、表达元件(expressionelements)：

1)启动子(promoter)：三类,即

lac启动子、trp启动子和它们的杂合启动子tac或

trc,都受IPTG诱导。

T7噬菌体启动子

31

入噬菌体的PL启动子。

2)终止子：依赖于P因子或不依赖于P因子(遇茎

环结构而终止)。

3)核糖体结合位点(ribosomebindingside,RBS)：

Shine-Dalgarno(SD)序列，ATG与RBS之间的距离

很重要，一般3-llbp。

2、表达形式

完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。

融合蛋白(fusionprotein)：多个基因的编码区的串

联体，但构成一个整体的单一0RF,如果融合标签蛋

白有利于蛋白的定向、纯化,如果融合多个目标蛋白,

则类似于直接表达了一个多酶复合体一样,可减少载

体构建难度,而且可以偶连两个或多个相关基因的表

达。

3、表达的控制

诱导表达系统：IPTG

防渗漏表达系统：laclq

PL启动子受cl的调控，低温(30C)下阻抑转录，高

温(40-45℃)下解除抑制。

4、分泌表达载体：产物可跨膜分泌至胞周间隙，可

避免受细胞内蛋白酶的降解，或使其正确折叠，或去

除N-端甲硫氨酸，以维护活性。

信号肽(signalpeptide)有碱性磷酸酶信号肽、蛋白

32

质A信号肽(如Amersham公司的pEZZ18系统)。

四、表达产物的纯化

1、包涵体(inclusionbody)的纯化：许多情况下表

达产物在细胞内形成不溶的颗粒状包涵体,可通过机

械法、冻融法、超声波处理等破碎细胞，离心收集包

涵体，洗涤去除杂蛋白，用盐酸胭、尿素和SDS溶解

包涵体，再通过一定的法使蛋白质折叠。

有的经上法得到后仍然有活性,有的蛋白一旦形成包

涵体后就没有活性了，但可作为抗原。

2、可溶性蛋白的纯化：表达的蛋白可以细胞内呈可

溶状态，也有少量进入细胞周质区。将细胞裂解物的

上清部分用于纯化目标蛋白，甚至可直接作为粗酶液

进行生化反应。

第二节穿梭载体

**穿梭载体(shuttlevector)：能够在两类不同的宿

主中复制、增殖和选择的载体，主要是质粒，它们至

少有两套复制单元和两套选择标记,相当于两个载体

的联合。

只要涉及大肠杆菌以外的细胞,绝大多数载体都装有

大肠杆菌质粒载体的基本元件，都可看作穿梭载体。

一、大肠杆菌/革兰氏阳性菌穿梭载体：如向枯草芽

抱杆菌的穿梭。

二、大肠杆菌/酵母菌穿梭载体：主要用于遗传学和

33

真核表达研究，尤其是当蛋白需要进行真核修饰时，

如磷酸化、糖基化等。

三、其它穿梭载体：如动物病毒载体、植物转化的

Ti质粒、昆虫杆状病毒等，更为复杂一些。

第三节整合载体

整合载体(integrationvector)：用于将某个基因或

某些基因插入到宿主的染色体中去工作,按整合方式

可分为定点整合和随机整合两类,按作用可分为目的

基因的插入/敲除或随机突变体库的构建。

一、基因插入/基因敲除

同源重组整合载体最为常用，不仅含有大肠杆菌克隆

载体的骨架，还有一段便于同源重组的重组DNA片

段。

二、随机插入突变载体

用于功能基因组研究中基因突变材料的创造。

随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过

DNA重组事件随机插入到基因组中而形成的众多基

因突变体的集合。

1、微生物插入突变体库：如pEG922,需要借助转座

子。

2、构建植物突变体库所用的载体：

根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的

T-DNA插入或植物转座子(transposon)标签是植物

34

基因功能研究中常用的产生突变体的方法

1)T-DNA插入突变体：植物转基因过程中T-DNA区

段如果插入到一个功能基因中，会导致该基因插入失

活而产生性状变化，形成突变体。

还可以在T-DNA区段构建基因激活标签、基因陷阱

(genetrap)＞启动子陷阱(promotertrap)或增强子

陷阱(enhancertrap),用于直接克隆靶基因编码区、

启动子、增强子等。

对于突变基因，只需要采用反向PCR或锚定PCR扩增

或通过筛选文库，就可以直接克隆得到其序列。

2)植物Ac-Ds转座子双因子插入突变：玉米Ac

(activator)因子是一个转座子,含有完整的转座酶,

Ds(dissociation)是Ac缺失转座酶基因的缺失体,

但具两端的反向重复序列。

分别构建含Ac和Ds的质粒载体载体并分别转化植

物,转基因植株杂交(AcXDs)后代中会发生转座事件

而产生突变体。

利用Ac-Ds序列作探针或引物克隆目标基因

3)构建动物随机突变体库常用载体：用基因陷阱。

基因陷阱的基本原理是通过携带有报告基因的载体

随机整合到动物或其它生物染色体,干扰内源基因的

功能，并标记被插入的基因，然后克隆之，方法同前

面的植物的方法一样。

35

动物的转化方法与植物不同，一般采用电转化、反转

录病毒转染、注射法等。

第六章基因操作中大分子的分离和分析

第一节DNA的分离、检测和纯化

**天然DNA来源:①染色体DNAo②病毒和噬菌

体DNA。③质粒DNA。④线粒体和叶绿体DNA。

一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化

分离质粒DNA的方法众多，其依据是利用分子大小

不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭

合环状结构的特点来进行分离。目前常用的有碱裂解

法、煮沸法、去污剂（如Triton或SDS）裂解法、竣

基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法等。

1碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理

碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表,

基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到

分离目的。

♦在pH高达12.5的碱性条件下,染色体DNA的氢键

断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢

键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会

完全分离。

♦当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时,

变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，

而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。

36

♦通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋

白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

**碱抽提法所用试剂的作用

提取过程中所用的材料有LB培养基、TE缓冲液、溶

菌酶液、溶液I即葡萄糖/Tris/EDTA溶液(50mmol/L

葡萄糖;25mmol/LTris-HCl；pH8.0,10mmol/LEDTA)、

溶液D即NaOH-SDS溶液、溶液UI即3mol/L乙酸钾溶

液、酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇、异丙醇、100%

乙醇、70%乙醇等。

①溶菌酶:溶菌酶是糖昔水解酶，水解菌体细胞壁的

主要化学成分肽聚糖中的8-1,4糖昔键，因而具有

溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，维持渗透压，防止

DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金属离子，抑制脱

氧核糖核酸酶对DNA的降解作用，同时有利于溶菌酶

的作用。

②NaOH-SDS液:NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时,

该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质

粒DNA的变性。

SDS是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂

质与蛋白，因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中

的核蛋白，还能与蛋白质结合成为R-0-S03-…R+-蛋

37

白质的复合物,使蛋白质变性沉淀下来。

③KAc:pH4.8的KAc溶液是为了把pH12.6的抽提液

调节至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定

存在。

高盐3mol/LKAc有利于变性的大分子染色体DNA、

RNA以及SDS-蛋白复合物的凝聚而沉淀。染色体DNA

因为中和了核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，

钾盐与RNA、SDS-蛋白复合物作用后，形成钾盐形式

复合物，使沉淀更完全。

④无水乙醇:沉淀DNA,它的优点是可以任意比例和

水相混溶，且乙醇与核酸不会起任何化学反应，对

DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，

当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使

DNA失水而易于聚合。

⑤酚一氯仿:酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，

当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的

水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白质失去水合状态而

变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，

因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水

相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保

留在最下层。

⑥异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力，能减少抽提

过程中泡沫的产生。同时异戊醇有助于分相，使离心

38

后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相

维持稳定。

2通过试剂盒分离纯化大肠杆菌质粒DNA

DNA粗匐底二）

结合：在纯化柱底部覆盖一层硅胶膜，其下

匣部有一个小孔.质粒DZA样品加入纯化柱

后经过短暂离心，DNA结合在硅胶膜上，

力＞溶液便流到收集管中。

得

图洗涤：加入含50%乙醇的缓冲液洗涤硅胶

中

洗脱：加入少量水或低离子强度的缓冲液

号将DNA从硅胶膜中洗脱出来

卜口纯化的DNA样品

DNA纯化仔I自QIAprepSpinMiniprepKit操^^^册）

二、基因组DNA的分离

1、CTAB法

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十

六烷基三甲基溟化铁）是一种阳离子去污剂，具有

从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特

性。在高离子强度的溶液中OO.7mol/LNaCl）,

CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，但不能沉淀

核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类

等杂质后，加入乙醇或异丙醇进行沉淀，即可使核

39

酸分离出来。

该法的优点是适应面广，对任何生物的基因组DNA

提取均有效，产量高，缺点是DNA沉淀如果乙醇漂

洗不充分，污染在DNA产物中的CTAB对后续实验

有明显的抑制作用。

2、SDS法

以含EDTA、SDS、RNA酶的裂解液裂解细胞，经蛋

白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA,

通过乙醇沉淀，获得DNA。

该法的优点是简便，适应面也较强，效果也不错,

缺点是DNA产量稍低，且DNA稍易氧化变黄。

三、DNA的琼脂糖凝胶电泳

1、凝胶电泳的基本原理

一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移

向适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携

带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电

泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度越

快，反之则较慢。

电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移

率。

2、影响电泳迁移速率的因素：

1)分子筛效应

DNA分子在凝胶介质中泳动时有电荷效应和分子

40

筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负

电荷，在电场中向正极移动。由于糖一磷酸骨架在

结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有

等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方

向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速

度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构

型。

2)相对分子质量

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不

一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成

反比关系。

DNA样品与已知相对分子质量大小的标准DNA片段

进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品

的相对分子质量大小。

凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA,

也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA

分子。

3)构型

在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使

超螺旋(SC)的共价闭合环状(CCC)结构的质粒DNA

的一条链断裂，变成开环状(0C)分子，如果两条链

发生断裂，就转变为线状(L)分子。这3种构型的

41

分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型分

子迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环

状分子。当提取到的质粒DNA样品中还有染色体

DNA或RNA时，在凝胶电泳上也可以分别观察到电

泳区带，由此可分析样品的纯度。

3、DNA的琼脂糖凝胶电泳

1)DNA的显示原理：

制备琼脂糖凝胶时加入滨化乙锭指示剂，漠化乙

锭(EB)在紫外光照射下能发射桔红色的荧光。当

DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的

EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发

射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含

量,如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对

照，就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫

描仪检测，只需要5〜10ngDNA,就可以从照片上

比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.01〜0.1P

g的DNAo

2)影响电泳迁移的主要因素：

♦DNA的大小

♦DNA的构象

♦琼脂糖浓度

♦缓冲液：乙酸盐缓冲液(TAE)、硼酸盐缓冲液

(TBE)、磷酸盐缓冲液(TPE)。

42

**分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度

琼脂糖含（%）吆冬左段的直效分离范围（kb）

0.3____________5_60____________

0.51-30

______0^6__________________1_20____________

0.7___________0.8-12___________

1.00.5-10

1.2___________046___________

______1^5_________________0.2-4___________

______2^0______0.1-3

3）琼脂糖凝胶电泳的操作过程

A、缓冲液制备

B、EB母液配制：10mg/mL在4c下保存

C、将点样梳洗净干燥放入胶板中

D、琼脂糖胶板的制备：

称量加入三角瓶一定的琼脂糖粉末，

按所需凝胶浓度加入适量体积的缓冲液,将三角瓶

塞口，微波炉中融化。融化好后冷却到60℃左右,

加入EB溶液，至最终浓度为0.5ug/ml。摇匀倒入

放置好的点样梳的胶板中，排走气泡。室温放置

30-45mino

E、加样和电泳：

将胶板放入电泳槽，注入缓冲液，使液

面高于胶面排出加样孔内的气泡，用微量

移液枪加入DNA样品。接通电源，调好电压和电泳

43

时间。可根据澳酚兰的位置结束电泳，关闭电源。

F、取出凝胶，置于紫外投射仪上，调好相机焦距

拍照

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳

特点：

分辨率高

适于寡聚核昔酸及DNA序列分析，DNA<500bp

载样量大

回收DNA纯度高

五、脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgel

electrophoresisPFGE)

与常规的直流单向电场凝胶电泳不同,这项技术采

用定时改变电场方向的交变电源,每次电流方向改

变后持续1秒到5分钟左右，然后再改变电流方向,

反复循环，所以称之为脉冲式交变电场。

六、紫外吸收法检测DNA的浓度和纯度

紫外光谱分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在

260nmm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统

中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状、双链与单

链之间的转换也会导致吸收水平的改变,但是这种

偏差可以用特定的公式来校正o特点是准确、简便。

衡量所提取DNA的纯度可用0D260与0D280的比

值,0D260/0D280对DNA而言其值大约为1.8。

44

当0D260/0D280大于1.8则可能有RNA污染。

当0D260/0D280小于1.8时则有蛋白质污染。

双链DNA的0D260为1时相当于浓度为50口g/mL。

单链DNA的0D260为1时相当于浓度为40口g/mL。

寡核酸的0D260为1时相当于浓度为20-40ug/Ml

七、DNA片段的纯化

根据实验要求不同，有时需要高纯度的

DNA,对提取的DNA样品须进一步纯化并除去漠化

乙锭(EB)。先后出现的DNA纯化方法有：低熔点琼

脂糖凝胶电泳法、透析袋电洗脱法、氯化钠-漠化

乙锭连续梯度离心法、离子交换层析法、“基因纯”

试剂纯化、GlassMilk(bead)结合法、Qiagen

柱纯化等，目前以后两种方法的试剂盒法最常用，

简单且效果好。

**透析袋电洗脱法

令适用于小剂量DNA纯化和酶切DNA片段回收。

令DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带。

令切取含待纯化DNA带的琼脂糖凝胶块，装入透

析袋，进行电泳l-2h后，再反向电泳l-2min。

令吸取透析袋中的洗脱液于离心管中离心。

令转移上清液到另一离心管中，加入2倍体积无

水乙醇混匀，于-20℃放置过夜沉淀后，离心后

45

上清液，最后把沉淀物溶于TE缓冲液中，-20℃

保存备用。

**DNA的浓缩

当提取的DNA溶液的浓度达不到实验要求时,必须

进行DNA溶液的浓缩。实验室常用的方法有：乙

醇沉淀法、正丁醇抽提法和聚乙二醇浓缩法等

第二节RNA的分离、检测和纯化

细胞中的核酸：DNA和RNA。

RNA：rRNA、tRNA、mRNA。

一个典型哺乳动物细胞约含ICTugRNAo

一80%〜85%rRNA（28S>18S、5SrRNA）o

一15%〜20%低分子量RNA（如tRNA、核内小分子

RNA等）。

一1%〜5%mRNA,一般按2%计算。

令**实验成败关键：创造一个无RNase的环境

◎去除外源性RNase的污染：DEPC（焦碳酸二

乙脂）

◎抑制内源性RNase的活性

<3>RNase阻抑蛋白（RNasin,非竞争性

抑制剂）

3氧铜核糖核昔复合物硅藻土

46

**RNA的抽提与纯化

总RNA的制备

1、酚-异硫氟酸服抽提法(TRIZOL法)

Invitrogen公司产品，核心是利用胭盐使蛋白质迅

速变性，RNA酶也迅速失活，因此RNA降解风险小，

完整性好。由于是酸性溶液，DNA随杂质一起沉淀，

而RNA则溶液在溶解在溶液中，通过离心去渣、上清

乙醇沉淀、再离心后，得到RNA沉淀，稍事漂洗和干

燥后，溶解即可。

2、硅胶膜纯化法

以Qiagen公司的Rneasy试剂盒为代表,将生物材料

的异硫氨酸胭裂解液上到离心柱上,柱芯中的硅胶膜

选择性地吸附RNA,而其它杂质则在随后的步骤中洗