生物技术-基因工程原理课件 5第五章 克隆载体

第五章克隆载体4/24/20231ThemolecularanalysisofDNAhasbeenmadepossiblebythecloningofDNA.ThetwomoleculesthatarerequiredforcloningaretheDNAtobeclonedandacloningvector.Cloningvector-aDNAmoleculethatcarriesforeignDNAintoahostcell,replicatesinsideabacterial(oryeast)cellandproducesmanycopiesofitselfandtheforeignDNA.4/24/20232AcloningvectorisasmallDNAvehicleintowhichaforeignDNAfragmentcanbeinserted.TheinsertionofthefragmentintothecloningvectoriscarriedoutbytreatingthevehicleandtheforeignDNAwiththesamerestrictionenzyme,thenligatingthefragmentstogether.Therearemanytypesofcloningvectors.Geneticallyengineeredplasmidsandbacteriophages(suchasphageλ)areperhapsmostcommonlyusedforthispurpose.Othertypesofcloningvectorsincludebacterialartificialchromosomes(BACs)andyeastartificialchromosomes(YACs).4/24/20233DNA分子作为载体的条件复制子(replicon)的功能具有选择性标记(Selectivemarker)具有多克隆位点(Multi-cloningsite,MCS)表达载体还需具备调控区域，如启动子、核糖连接位点等。背景清楚4/24/20234第一节质粒载体(Plasmid)American

molecularbiologistknownforhisworkingenetics,artificialintelligence,andspaceexploration.Hewasjust33yearsoldwhenhewonthe1958NobelPrizeinPhysiologyorMedicinefordiscoveringthatbacteriacanmateandexchangegenes.HesharedtheprizewithTatumandBeadlewhowonfortheirworkwithgenetics.Inadditiontohiscontributionstobiology,Lederbergdidextensiveresearchinartificialintelligence.ThisincludedworkintheNASAexperimentalprogramsseekinglifeonMarsandthechemistry

expertsystem

Dendral(质谱系统).JoshuaLederberg(1925–2008)1952年发现质粒的人4/24/20235Aplasmidisanextra-chromosomalDNAmoleculeseparatefromthechromosomalDNAwhichiscapableofreplicatingindependentlyofthechromosomalDNA.Inmanycases,itiscircularanddouble-stranded.Plasmidsusuallyoccurnaturallyinbacteria,butaresometimesfoundineukaryoticorganisms(e.g.,the2-micrometre-ringinSaccharomyces

cerevisiae).Plasmidsizevariesfrom1toover200kbp.Thenumberofidenticalplasmidswithinasinglecellcanbezero,one,oreventhousandsundersomecircumstances.Plasmidscanbeconsideredtobepartofthemobilome,sincetheyareoftenassociatedwithconjugation,amechanismofhorizontalgenetransfer.4/24/20236Plasmidscanbeconsideredtobeindependentlife-formssimilartoviruses,sincebotharecapableofautonomousreplicationinsuitable(host)environ-ments.Howevertheplasmid-hostrelationshiptendstobemoresymbioticthanparasitic(althoughthiscanalsooccurforviruses,forexamplewithEndo-viruses)sinceplasmidscanendowtheirhostswithusefulpackagesofDNAtoassistmutualsurvivalintimesofseverestress.Forexample,plasmidscanconveyantibioticresistancetohostbacteria,whomaythensurvivealongwiththeirlife-savingguestswhoarecarriedalongintofuturehostgenerations.4/24/20237在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，已经作了比较详尽研究的主要有3种：①F质粒:又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。②R质粒:

通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。③Col质粒:

即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。一、质粒的一般分类4/24/20238二、接合质粒和非接合质粒接合质粒的生物学性状是宿主细胞的DNA可以通过质粒DNA完成从供体细胞向受体细胞的转移。4/24/20239R质粒因同时具有tra和mob，可以进行接合和转移ColE1因仅有mob，没有tra，所以仅能进行转移，而不能接合。它只能通过F或F类似的质粒进行接合和转移。如果tra和mob都缺失的话，即不能接合，也不能转移。如果缺失了一部分的mob，且缺失的部分仅与转移蛋白的拷贝有关，则可通过另一组基因nic/bom来代偿。顺式作用元件nic/bom不会与其它质粒发生交换，因此从生物安全的角度看，非接合质粒是安全的。4/24/202310质粒的产物可以作为选择性标志质粒在细胞中的产物是特异的、容易识别的，质粒可使受染的细胞产生相应的性状，如抗生素的抗药性。抗性基因多位于转座子中。它可以插入到宿主染色体的任一位置。抗药性不仅可以随质粒的转移而转移，也可以通过侧面的插入而转赠给没有抗性的细胞！在质粒中还有一个所有质粒都具有的区域：复制起始位点。质粒还具有自主复制的能力4/24/202311质粒的拷贝数受基因调控严紧型质粒接合质粒大质粒低拷贝松弛型质粒非接合质粒小质粒高拷贝非接合质粒的高拷贝是人工构建载体的第二个有利条件！氯霉素可以增加质粒的拷贝数氯霉素由委内瑞拉链霉菌的培养液中提取而得，抗菌作用机制是与核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成。为什么氯霉素可以增加非接合质粒的拷贝数？4/24/202312不同质粒复制机制的差异尽管不同的质粒可以有相同的宿主，但它们在复制机制和酶学方面具有以下5方面的差异：对宿主酶的依赖性不同。使用的DNA聚合酶不同。复制的方向性不同。复制的终止位点不同：单向复制终止在启始位点；双向复制可以同时到达同一位点时发生终止，也可先后到达；还可有固定的终止位点。复制的模式有差异。4/24/202313质粒复制的调控机制(一)(A)SimplifiedversionofthebasicrepliconofplasmidR1.Therepliconcontains:anoriginofreplication,oriR1;thestructuralgene,repA,whichencodestheinitiatorproteinRepAthatbindstooriR1;CopA,whichnegativelyregulatesthetranslationoftherepAmRNA;andtheconstitutivePcopAandPcopBpromoters.(B)Theautorepressormodel.Thetwogenes(P1andP2)intheregulatorycircuitformanoperon(OP,operatorandpromoter).TheP1productisanautorepressoroftheoperonandtheproductofP2istheinitiatorproteinofreplication.4/24/202314质粒复制的调控机制(二)4/24/202315质粒复制的调控机制(三)4/24/202316质粒复制的调控机制(四)质粒Daltonkbp接合拷贝数复制能力选择性标记ColE14.2X1067-10-15+E1imm*RSF10305.6X1069.3-20-40+AprCloDF136.0X10610-10+DF13imm*pSC1015.8X1069.7-1-2-TcrR6K25X10642+10-40-AprSmrF62X106103+1-2--R165X106108+1-2-AprCmrSnrSnrSmrKmrRK238X10656.4+3-5-AprKmrTcr4/24/202317接合质粒的稳定性质粒从母代细胞向子代细胞转移的概率：P＝2(1/2)n公式中，n为细胞的分裂次数。问题：用接合质粒还是非接合质粒作载体好？4/24/202318质粒DNA作为载体的条件可以在宿主细胞中自主复制至少有一个选择性标志背景清楚，具多克隆位点多克隆位点应该位于某选择性标志中分子量小高拷贝4/24/202319pBR322载体的构建4/24/202320pUC18/19形体结构图4/24/202321α-互补

(αcomplementation)载体DNA上带有一段大肠杆菌的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因的调节基因及lacZ的N端146个氨基酸残基编码信息(α片段)。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，这个多克隆位点并不破坏阅读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶N端，而不影响其功能。这种载体适用于可表达该酶的W片段(酶的C端)的大肠杆菌。4/24/2023224/24/2023234/24/202324虽然载体和宿主各自单独表达的α及W片段均无β半乳糖苷酶活性，但二者的产物却可以融为一体，形成具有β半乳糖苷酶活性的蛋白质。这种使LacZ基因缺失各一部分突变体的互补，叫做α-互补。4/24/202325蓝白反应(white-bluereaction)一般情况下，在诱导剂IPTG(异丙基--D-硫代半乳糖苷)存在的情况下，它可以使载体与宿主细胞共同产生具有酶学活性的

-半乳糖苷酶，从而使生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷)变为兰色。而在多克隆位点插入了外源性DNA后，必然导致产生无α-互补能力的多肽链，因此，重组的质粒呈白色。4/24/202326第二节噬菌体载体一、噬菌体基因组的分子生物学噬菌体DNA全长48502bp，约编码50个基因，在病毒中呈双链线状结构，其两端有一长约12b的单链互补的末端，称为cos位点，可在宿主中形成环状结构。基因组的物理图谱和基因结构38个基因的位置、标识及限制性内切酶的酶切位点4/24/202327噬菌体的基因调控这是噬菌体从28kbp～48kbp之间的基因组DNA表达的调节示意图；①②③表示溶菌周期的早、中、晚三个阶段。N和Q产物作为中晚期的正调控因子；P’R是晚期的转录产物，它的表达，使噬菌体在受染细胞中环化。在溶源周期④由于抑制蛋白CI和CII从启动子PRE和PRM开始转录，具插入作用的int从启动子P1开始大量合成。4/24/202328二、噬菌体的生活史4/24/202329三、载体的重组容量从基因组中，将基因I到N的区域全部删除，这一部分在溶菌状态不起作用。原则上将这时的噬菌体就可以作为载体了。它可以容纳大约30X485＝14550bp的外源性DNA。DNA至少应该保留75％，即为37kbp，才能形成有效的噬菌斑；而在的头部可以容纳基因组105％的DNA，即52kbp。这样载体的容量应该：52kbp－37kbp＝15kbp4/24/202330四、载体的类型通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体称为插入型载体(insertionvectors)。由于λ噬菌体对所包装的DNA有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6kb外源DNA片段，最大11kb。

4/24/202331gt11载体gt11载体允许插入的DNA片段大小为0～7.2kb。它用于构建cDNA

文库、基因组文库和表达融合蛋白。该载体最大的特点是在最左侧可替代区置换了一段lac5基因，可编码-半乳糖苷酶，在IPTG/X-gal平板上形成兰色噬菌斑。

lac5基因编码区终止密码子之前有一个EcoRⅠ位点(53bp上游)，可用于外源DNA片段的插入。筛选时，在

lac-宿主菌中非重组噬菌斑为兰色。当外源DNA片段与lacZ

的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子。4/24/202332gt11载体带有S基因的琥珀突变Sam100

，该突变可被supF

抑制，因此该载体需要在supF

宿主菌内进行增殖和筛选。S基因是噬菌体从宿主细胞释放前参与溶解细菌细胞膜的一个基因，该基因突变后，引起感染性噬菌体在非抑制性宿主细胞内发生积累。gt11载体还带有cI基因的温度敏感突变cI-ts857,该基因产物对温度敏感。在32C时，cI-ts857基因产物有活性，可使相应的噬菌体处于溶源状态；当温度提高到42C时，cI-ts857基因产物失去活性，导致噬菌体进入裂解生长。根据这一性质，可用来控制噬菌体的复制和融合蛋白的表达。E.coliYl090和Yl089(hsdR)可作为受体菌，用于载体的增殖和文库的筛选；该菌具有高频溶源特性，可用于融合蛋白的分析和检测。

4/24/202333ZAPⅡ

ZAPⅡ整体上与gt11相似，不同的是在基因J和att

位点之间用pBluescriptSK质粒片段取代了相应的噬菌体片段，大小为41kb，允许插入0-10kb的外源片段。因此，该载体具备了pBluescriptSK质粒的一些特性，如-互补以及可通过启动子合成RNA探针。

4/24/2023344/24/202335置换型载体允许外源DNA片段替换非必须DNA片段的载体，称为置换型载体(replacementvectors)。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是9～23kb，故而该载体主要用来构建基因组文库。4/24/202336EMBL3和EMBL4这两个载体大小为43kb，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为20kb、9kb和14kb。从提高克隆效率角度来看，它们克隆DNA片段的大小为9-23kb。在填充片段中带有red和gam基因，当外源片段替换填充片段后，重组体将变成

red-gam-，同时载体上含有chiC位点，因此可用P2噬菌体的溶源性大肠杆菌进行Spi筛选重组体。在填充片段两端带有对称的多克隆位点，这两个载体的差别是多克隆位点的排列位置相反。BamHⅠ位点适合克隆用

Sau3AⅠ部分消化的外源DNA片段，在得到阳性克隆后，可用SalⅠ或EcoRⅠ将外源片段从重组载体上切割出来。4/24/202337第三节

粘粒载体粘粒(cosmid)是带有

cos序列的质粒。cos序列是噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。粘粒含有质粒复制起点(colE1)，抗性标记(ampr)，cos位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般5-7kb左右，用来克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可达45kb。有的粘粒载体含有两个cos位点，在某种程度上可提高使用效率。4/24/202338粘粒载体的工作原理粘粒克隆的主要原理类似噬菌体载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于噬菌体载体的左右臂，

cos位点通过粘端退火后，再与外源片段相间连接成多联体。当多联体与噬菌体包装蛋白混合时，噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间的片段包装到噬菌体颗粒中去。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组DNA就像噬菌体DNA一样被注入细胞并通过cos位点环化，这样形成的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。4/24/202339粘粒文库的扩增和贮存将已包装的重组粘粒转导至大肠杆菌中，并使之生长在铺于LB琼脂平板的硝酸纤维素滤膜上。通过影印到其他滤膜上，使文库得到扩增，于-70℃保存。将已包装的重组粘粒转导至大肠杆菌中，在平板上长出单菌落后，挑取所有单菌落，并使之混合生长数代，使文库得到扩增。扩增的文库经分装后于-70℃保存，需要时取一份用于分析。将已包装的重组粘粒转导至大肠杆菌中，在平板上长出单菌落后，挑取所有单菌落，并使之混合生长有限世代，用重组缺陷(red-)和裂解功能突变的λ噬菌体进行超感染，大肠杆菌中的重组粘粒DNA可被重新包装，并形成噬菌体颗粒，经物理方法破裂细胞可获得噬菌体颗粒混合物。这样扩增的文库可像λ噬菌体文库一样保存，但其操作步骤复杂。4/24/202340第四节单链丝状噬菌体载体M13噬菌体的组成和结构M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。

M13噬菌体的基因组为单链DNA，由6407的碱基组成。基因组90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。M13噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长880nm，直径6-7nm。噬菌体颗粒的核心由基因Ⅷ编码的2700个结构蛋白呈管状排列而成。4/24/202341M13噬菌体的遗传图谱和核心颗粒结构模型4/24/202342单链噬菌体载体的用途双脱氧法进行DNA序列分析时的模板制备单链的、放射性标记的探针利用寡核苷酸进行定点诱变4/24/202343第五节人工染色体载体一、酵母人工染色体(Yeastartificialchromosomes)YAC人工染色体载体是利用酿酒酵母(Saccharomyces

cerevisiae)的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90分钟；含16条大小为225-1900kb染色体，共有14×106bp。YAC的一个突出优点是，酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的DNA有更强的容忍性。另外，YAC在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子，大型基因组片段可通过YAC载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究。4/24/2023441．YAC人工染色体载体的复制元件在YAC载体中最常用的是pYAC4。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。

YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列(autonomouslyreplicatingsequence，ARS)、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒(centromere,CEN)和两个端粒(TEL)。

4/24/202345

2、YAC载体的选择标记YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp

1、leu

2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突变抑制基因sup4。与YAC载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade

2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade

2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。

4/24/2023463、YAC载体的用途YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。YAC载体功能强大，但有以下3方面的弊端：①在YAC载体的插入片段会出现缺失(deletion)和基因重排(rearrangement)；②容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的5%～50%。③YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。

4/24/202347二、细菌人工染色体载体(BAC)F质粒

大肠杆菌的F因子是一个约100kb的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质。虽然F因子通常以双链闭环DNA(1-2个拷贝/细胞)的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行随机整合。携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。(Bacterialartificialchromosomes)4/24/2023482、细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosomes)是基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子(致育因子)的严谨型控制的复制子oriS，一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶(RepE)以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座(parA,parB,和parC)。BAC载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。

4/24/202349第一代BAC载体不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的BAC载体可以通过α互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆DNA的NotI酶切位点和用于克隆DNA测序的Sp6启动子、T7启动子。NotⅠ识别序列，位点十分稀少。重组子通过NotⅠ消化后，可以得到完整的插入片段。Sp6、T7是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。

4/24/202350BAC与YAC和PAC(P1artificialchromosomes，P1人工染色体)相似，没有包装限制，因此可接受的基因组DNA大小也没有固定的限制。大多数BAC文库中克隆的平均大小约120kb，然而个别的BAC重组子中含有的基因组DNA最大可达300kb。

F质粒能够编码形成性菌的蛋白，通过大肠杆菌的结合转移可以进行遗传物质的转移。但是基因操作的时候一般不用这种自发的转化方式。BAC载体空载时大小约7.5kb，在大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组DNA片段可以通过酶切、连接克隆到BAC载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源DNA后的重组质粒通过氯霉素抗性和LacZ基因的α-互补筛选。4/24/2023513、P1噬菌体载体(BacteriophageP1vectors)是基于P1噬菌体构建的，与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。它含有很多P1

噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳70～100kb大小的基因组DNA片段。在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在体外被组装到P1噬菌体颗粒中，后者总容量可达115kb(包括载体和插入片段)。将重组DNA注射到表达Cre重组酶的大肠杆菌中，线状DNA分子通过重组于载体的两个loxP位点之间而发生环化。另外，载体还携带一个通用的选择标记kanr，一个区分携带外源DNA克隆的阳性标记sacB以及一个能够使每个细胞都含有约一个拷贝环状重组质粒的P1质粒复制子。另一个P1复制子(P1裂解性复制子)在可诱导的lac启动子控制下，用于DNA分离前质粒的扩增。4/24/2023525、P1人工染色体(P1artificialchromosomes)

结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB及噬菌体P1的质粒复制子和裂解性复制子。然而除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在cre-loxP位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组PAC也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状态维持。基于PAC的人类基因组文库插入片段的大小在60kb～150kb之间。4/24/202353第六节表达载体根据表达的性质可以分为：融合表达载体、非融合表达载体、穿梭载体、整合载体一、大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。4/24/2023541．表达融合蛋白的表达载体当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。通过以融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽(Tag)，常用的有谷胱甘肽转移酶(glutathioneS-transferase,GST)、六聚组氨酸肽(polyHis-6)、蛋白质A(proteinA)和纤维素结合位点(cellulosebindingdomain)等。4/24/202355①表达LacZ

融合蛋白的载体如pEX1/2/3载体，PR受cIts857控制，宿主M5219含缺陷性原噬菌体，编码cIts857和N蛋白。cIts857强烈抑制基因转录。N基因可使RNA聚合酶跨过基因内部潜在终止位点。一般采用42-45℃灭活cIts857阻遏物，此处采用40℃以减少热激蛋白的诱导并使细菌能继续生长。因为温度转换不仅可诱导PL/PR启动子，也可诱导热激基因，而后者有些可编码蛋白酶。4/24/202356②表达GST融合蛋白的表达载体GST表达载体在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列，其一是谷胱甘肽转移酶基因，其二是凝血蛋白酶(Thrombin)切割位点的编码序列。当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。GST是来源于血吸虫的小分子酶(26kDa)，在E.coli易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出来。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外，其它还有Xa因子(FactorXa)和肠激酶。4/24/202357③利用T7噬菌体启动子的表达载体表达载体pET-28a是典型的pET

载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。

4/24/2023584/24/2023594/24/202360④分泌型表达载体除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。这种表达方式可避免细胞内蛋白酶