微生物工程工艺原理实验讲义

试验一酒精连续发酵试验试验目的熟悉和了解连续发酵过程前发酵、主发酵、后发酵的酒精发酵动态。驾驭酒精连续发酵过程中各种参数的变更规律。通过试验分析初步驾驭酒精发酵的工艺技术。加强综合分析问题，解决问题和动手实力的训练和造就。试验原理酒精发酵一般接受间歇式和连续式两种工艺方法。间歇式发酵从接种至酒精发酵完毕全过程均在一个发酵罐中完成。酵母菌种的生长和代谢是在糖分不断下降，酒精浓度不断增加的过程中进展的。这种状况会对酵母的生长代谢产生抑制作用，使酒精发酵率降低。连续发酵工艺可以克制间歇发酵的缺点和缺乏。特别是多级连续发酵工艺，其发酵的每一阶段是在不同的发酵罐中进展，依据连续发酵的原理，对整个连续发酵系统中的每一个发酵罐来说，罐中的基质浓度，细胞浓度，酒精浓度，PH、发酵温度等因素都是稳定的。这样对酵母的生长代谢有利，其发酵实力增加，发酵率也相应提高。在酒精连续发酵系统中，一般前面两个发酵罐称为流加罐或酵母增殖罐，酵母菌和新颖稀糖液先进入这两罐，然后自然流入下一罐，主要限制好稀糖液流加速度使发酵到达平衡。这样酵母菌在1#和2#发酵罐中生长和代谢都特别旺盛，使连续发酵系统一起先就处于主发酵阶段，大大缩短了发酵周期，及间歇发酵比拟提高了设备利用率。依据连续发酵动力学原理、酒精连续发酵听从于单分子反响定律，即糖的发酵速度常数可用下式表示：上式中：K——发酵速度常数

t——发酵时间

S0——发酵前醪液中的糖浓度

S——发酵t时间后醪液中的糖浓度在连续发酵过程中，发酵时间可用下式表示：(小时)上式中：f——发酵醪的流速〔米3/小时〕

v——发酵罐中所装醪液的体积〔米3〕发酵罐中醪液的体积是指酒精浓度到达最高值前全部罐中发酵醪的体积。例如有7个发酵罐组成的发酵系统，当测定第5号罐时酒精浓度已到达最高值，后两个罐已不再增加酒精浓度，应以1～5号的醪液总体积为计算依据，6～7号罐的醪液体积可不计算。在稳定状态下，连续发酵罐中菌体的比生长速率为：式中：μ——比生长率，其余参数同前。发酵液的稀释度为：

式中：D——发酵醪液稀释度，其余参数同前。试验装置本试验接受单浓度流加多级连续发酵工艺，试验装置接受多个小型发酵罐串连而成，发酵醪接受下部进料上部出料的流淌方式，这样能削减发酵醪在罐中的短路现象，以保证发酵醪先进先出的工艺要求。其工艺流程图1如下：试验方法酵母菌种的扩大造就原菌试管种新颖斜面试管活化造就液体试管造就大三角瓶造就酒精连续发酵试验。原菌试管种选用糖密原料酒精发酵常用菌种有古巴I，古巴II，F396等菌种，可依据实际状况选用。新颖固体斜面造就基的配制固体斜面造就基用10BX的米曲汁或麦芽汁适量，参与2%的琼脂在电炉上煮溶，趁热分装试管，每支试管装液量约10ml，塞好棉塞以1kg/cm2的压力杀菌20分钟，取出放成斜面。接入原菌，置恒温箱内保湿30℃造就3～4天后放入冰箱备用。液体试管造就在试管中装入约10ml左右的米曲汁或麦芽汁，塞好棉塞以1kg/cm2的压力灭菌20分钟，取出冷却至30℃左右，接入新颖斜面种，以30℃恒温造就24小时。菌种大三角瓶造就用三个500ml三角瓶分别装入加了养分盐的稀糖液约350ml〔稀糖液浓度为18～22BX，PH4.0～4.5〕以1kg/cm2的压力灭菌20分钟，取出冷却至30℃，每个三角瓶接入2支液体试管菌种，以30℃恒温造就14～20小时。酒精连续发酵发酵稀糖液的制备原糖密〔85～90BX〕称取4000克倒入桶中参与、〔NH4〕2SO416克、浓H2SO416ml稀释至55BX、PH4.5静置澄清2～8小时取上清液加水稀释至18～22BX加热至100℃冷却备用。发酵条件及限制发酵稀糖浓度取18～22BX、发酵Ph4.0～4.5、糖液流加速度约0.8～1.2升/小时、酵母数限制在1.0～1.2亿/ml，发酵温度为30～32℃，发酵时间约30小时，成熟醪含酒份约8%〔V〕，残总糖限制为0.35%左右。分析检测工程及方法发酵液PH值的测定PH值的测定可用仪器和试剂等方法进展。用仪器测定精确度较高，科研中常用，作为标准测定方法。用PH试纸测定虽不及仪器精确，但用法简便经济，根本能满足生产要求。两种测定方法如下：电位测定法原理图2用玻璃电极测定PH值示意图如图2所示，当指示电极〔玻璃电极〕和参比电极〔甘汞电极〕浸在同一溶液中时，便形成一个完整电池。此时可精确测出该电池和电动势、此电动势的大小及溶液的PH值有干脆关系。用玻璃电极测定溶液的PH值的根底在于：假如有一个传导的玻璃薄膜介于两个具有不同PH值的溶液之间，那么跨越这个玻璃薄膜就产生一个电势差。它可通过在每种溶液中各放一支具有确定恒定电势的参比电极〔一般玻璃电极的内参比电极为Ag——AgCl电极，外参比电极饱和甘汞电极〕并测得这两个电极间的电势差而求得，如下图跨越两个电极间的电势将作为两种溶液中氢离子活度a1和a2比值的变更函数，在25℃时有如下关系：图2用玻璃电极测定PH值示意图为了测定未知溶液的PH值，氢离子活度a2就保持恒定，一般在玻璃电极泡内放置0.1NHcl溶液的a2就恒定了，而a1为待测溶液的氢离子活度，可用下式表示。此式中K是一个新的常数，它包含了a2的对数函数，K值可通过测定一个氢离子活度和确定溶液的电势E而求出。因此，测定原电池的电动势，便可求出未知溶液的PH值。测定方法以PHS——3型酸度计为例，其测定方法如下：仪器运用前的准备首先把仪器和搅拌器的电源插头接在220V的沟通电源上，在搅拌器的电极杆上装上电极架，并将电极夹装在电极架上。放出“测量”开关，按下“PH”或“mV”按键〔即接通电源〕，使仪器颈预热120分钟，然后进展标定。在运用仪器测定被测溶液之前，必需先标定，一般来说在连续运用时，每天标定一次已能到达要求。〔如连续运用该仪器、不必关闭电源，这样仪器的稳定性更好〕，其标定步骤如下：放开“测量”开关，按下“mV”键。调整“零点”电位器读数在±0之间。按下PH键。先用蒸馏水清洗电极，再用确定PH值的缓冲液淋洗，然后将电极插入此确定PH值的缓冲液中〔如PH=4〕，调整“温度”调整器，使所指示的温度及溶液温度一样，开动搅拌器将溶液搅拌匀整。按下“测量”开头，调整“定位”调整器，使仪器计数及该缓冲液一样〔如PH=4〕。到此仪器的标定已完成，“定位”调整器不应再变动，即可测定未知溶液的PH值。溶液PH值的测定放开“测量”开关，“定位”保持不变。用温度计测出被测溶液的温度。调整“温度”调整器，使其指示在被测液的温度值上。用蒸馏水清洗电极、用滤纸吸干〔或用被测液淋洗〕插入被测溶液中，开动搅拌器，将溶液搅拌匀整。按下测量开关，读出该溶液的PH值。测量完毕，关闭各开关、截断电源，并清洗电极。测定留意事项酸度计应放置在坚实、枯燥和无腐蚀性气体的地方。在测定酸性溶液时，应用PH值低于7.0的缓冲液定位，测定碱性溶液时用高于PH值7.0的缓冲液定位。玻璃电极球如有裂纹或老化〔久放二年以上〕那么就更新电极，否那么反响缓慢，甚至造成较大的测量误差，新的电极在运用之前用蒸馏水浸泡24小时。仪器的输入端〔即玻璃电极插口〕必需保持清洁，不运用时将接续器插入，以防止灰尘及高温浸入，在环境温度较高的场所运用时，应把电极插入口用干净纱布擦干。玻璃电极球泡很薄，留意勿及硬物碰撞。玻璃电极和甘汞电极在运用时，必需留意内电极及球泡之间及内电极和陶瓷芯之间有否气泡停留，如有那么必需除掉。该仪器接受场效应晶体管和PNOS集成电路，它很简洁击穿，因此检修时应留意不要用电烙铁干脆焊接场效应晶体管的各极和PNOS集成电路，如有必要，应将电烙铁的电源拨除后才进展焊接。标准缓冲溶液的配制PH值4.0缓冲溶液：称取在115℃下枯燥的G.R级邻苯二甲酸氢钾10.21克，用重蒸蒸馏水溶解，移入1000ml容量瓶中，稀释至刻度。此缓冲液在15℃时，其PH值为4.0。PH值6.88缓冲溶液：称取在115℃下枯燥的G.R级磷酸二氢钾3.39克和G.R级磷酸氢二钠3.55克，以重蒸蒸馏水溶成1000ml，此缓冲液在15℃时PH值为6.9。PH值9.27缓冲溶液：称取G.R级硼砂〔不能烘〕3.81克，以重蒸蒸馏水溶成1000ml，此缓冲溶液在15℃时PH值为9.27。缓冲溶液PH值及温度关系参照表温度℃溶液邻苯二甲酸盐中性磷酸盐硼酸盐54.016.953.39104.006.929.33154.006.909.27204.006.889.22254.016.869.18304.026.859.14354.036.849.10404.046.849.07454.056.839.04504.066.839.01554.086.848.99604.106.848.96PH试纸比色法每一种指示溶液都具有必需的变色范围，利用这个变更可测定试液的PH值，PH试剂是由各种指示溶液浸制而成的，将试液滴在PH试剂上便呈现出颜色，及标准色样比拟就可以得出试液的PH值。酒精发酵液可用PH3.8～5.4范围的精细试纸测定，测定的方法是用枯燥干净的摄子夹取精细试纸的一条浸入稀糖液中，半秒钟后取出及标准色板比拟，即得稀糖液的PH值。留意PH试纸在日光下及空气中以及遇到酸性物质和二氧化碳等气体时，均能使它变质失效，故PH试纸宜在密闭枯燥处保存，测定前切使试纸受潮。发酵液酸度的测定酸度的定义酸度以中和100克糖液所消耗0.1N氢氧化钠溶液的毫升数表示。试剂配制0.1N氢氧化钠溶液称取4克氢氧化钠，溶于水并稀释至1000ml。并对该氢氧化钠溶液进展标定。标定方法如下：精确称取0.4克邻苯二甲酸氢钾〔预先于120℃烘2小时〕置于250ml角瓶中、加约50ml水溶解，加2滴1%酚酞指示剂，以0.1N氢氧化钠溶液滴定至微红色，登记所耗0.1N氢氧化钠的毫升数。计算如下：式中:W——邻苯二甲酸氢钾称取量〔克〕

V——消耗氢氧化钠溶液的体积〔ml〕

204.2——邻苯二甲酸氢钾的分子量〔克〕1%酚酞指示剂精确称取1克酚酞、溶于100ml95%酒精中。0.1%溴龙涏香蓝指示液精确称取0.1克溴龙涎香蓝，加50%的中性酒精溶成100ml后过滤备用。酸度的测定方法称取试样10克用中性蒸馏水〔PH±0.2〕溶解至100ml〔用100ml容量瓶〕作为检液。在250ml三角瓶中参与蒸馏水150ml、参与0.1%溴龙涏香蓝指示液2～3滴，用0.1N氢氧化钠溶液滴定至中性反响〔浅蓝色，PH±0.2〕，此次滴定耗用0.1N氢氧化钠的量不必记录，然后参与检液10ml〔相当于1克试样〕混合后，参与2～3滴定溴龙涏香蓝指示液，接着用0.1N氢氧化钠滴定至中性反响〔即黄绿色〕，并记录此次滴定所耗用0.1N氢氧化钠标准溶液的毫升数。滴定终点判定不明晰时、可按如下外指示剂法确定。在白瓷板上的数个孔内分别滴入溴龙涏香蓝指示液一滴，并于板中心的一个孔内参与中性蒸馏水0.5ml作为比色标准〔草绿色〕。在滴定快到终点时，每滴定2～3滴0.1N氢氧化钠后，即用玻璃棒带上一滴检液置于瓷板上的一个孔内，使其及指示液混合显色以判定终点。呈黄色——表示酸性，接着滴定。呈蓝色——表示碱性，即滴定过量应重做测定。呈草绿色——表示中性，即到达终点。结果计算式中：V——滴定时耗用0.1N氢氧化钠标准溶液的体积。

F——0.1N氢氧化钠标准溶液的当量系数。

——表示1克试样换算成100克试样的倍数。糖分测定原理糖份接受兰因——艾农〔Lane——Eynon〕恒溶法进展测定。首先将试样进展处理，运用中性醋酸铅和脱铅剂将试样中的可复原性的非糖份及钙盐等杂质去除干净，然后用盐酸使双糖转化为复原性的单糖。单糖在必需碱度的裴林氏溶液中使二价铜复原为一价铜，从而求出糖份含量。裴林氏甲乙液混合时生成可溶性的酒石酸钾钠铜络合物和硫酸钠。COOKCOOK||COOKCOOK||CHOHCHO||CuSO4+2NaOH+CHOH——CHO——Cu+Na2SO4+2H2O| |COONaCOONa酒石酸钾钠铜络合物中二价铜是一个氧化剂，反响时能释放出新生态氧，使二价铜复原为一价的亚铜。COOKCOOKCOOKCOOK||CHOCHOH||2CHO——Cu+2H20——2CHOH+Cu2O↓+[O]| |COONaCOONa(红色)复原糖的氧化过程OCOCOOHCOOH‖C—H|+[O]+2[O]R4———R4———R4+H2O|||CH2OHCH2OHCOOHR=CHOH(葡萄糖)CH2OHCOOHCH2OHCOOHCOOH‖C=OO|+[O]‖+3[O]R3———R3+HCH———R3+H2O|||CH2OHCH2OHCOOH(果糖)反响过程中每分子蔗糖耗用14个铜原子〔因为2个铜原子相当一个氧原子〕，即每分子复原性物质耗用7个铜原子，变即裴林氏混合液10ml内所含的铜量应耗用0.0357克复原物质。但实际滴定时那么随溶液的碱度不同而变更。如滴定总容量为20ml，那么耗用0.0504克复原物质〔即100分子单糖耗用496个铜原子〕，如滴定总容量为54ml，那么耗用0.0522克复原物质〔即100分子单糖耗用479个铜原子〕。这说明复原物质的氧化程度随着反响条件而变更的，因此要严格遵守各项试验规定、才能获得精确的结果。反响终点用次甲基蓝指示液显示，因次甲基蓝氧化实力较二价铜弱，故二价铜全部复原为一价铜后，过量一滴复原糖立刻把次甲基蓝复原，使溶液蓝色消逝以示终点。其反响式如下：试剂配制中性醋酸铅溶液称取中性醋酸铅250克〔Pb〔C3H3O2〕2·3H2O〕，加水500ml，搅拌使之充分溶解，静置、倾取上层清液，沉淀、过滤，在滤液中参与浓醋酸使呈中性或微酸性〔用石蕊试纸检测〕。再加新颖蒸馏水稀释至54BX〔比重1.25〕。脱铅剂称取磷酸氢二钠〔Na2HPO4·12H2O〕140克和草酸钾〔K2C2O4·H2O〕60克，用少量蒸馏水分别溶解，合并后稀释至2000ml。裴林氏甲乙液甲液：称取分析纯硫酸铜〔CuSO4·5H2O〕30克，次甲基蓝0.10克，用蒸馏水溶解后稀释至2000ml。乙液：称取分析纯酒石酸钾钠100克，分析纯氢氧化钠108克，分析纯亚铁氰化钾〔黄血盐〕8克，用蒸馏水溶解后稀释至2000ml。0.1%标准葡萄糖溶液精确称取已烘干的无水葡萄糖4克〔用1/10000天平称重，无水葡萄糖预先在烘箱中以110℃烘干至恒重，时间约2小时〕，用少量蒸馏水溶解，参与20ml浓盐酸防腐，并用蒸馏水定容至4000ml。20%氢氧化钠溶液〔称取80克NaOH加水溶解并稀释至400ml。〕20%HCl溶液〔量取80ml浓HCl缓慢倒入320ml水中〕。总糖的测定总糖检液的制备精确吸取试样10ml，用蒸馏水约50ml转移入100ml容量瓶中，加中性醋酸铅溶液3～5ml，加蒸馏水至刻度。假设泡沫过多难以定容，可加数滴酒精或丙酮除去泡沫。摇匀，以滤纸过滤至250ml三角瓶中，最初的10ml滤液洗涤三角瓶后弃去。用移液管精确吸取滤液50ml于100ml容量瓶中，加脱铅剂12ml，摇匀，静置3～4分钟，沿瓶壁加1～2滴脱铅剂，如不再生成浑浊方证明脱铅剂已足够。〔过量的铅会影响分析结果偏低〕。加蒸馏水至刻度，摇匀，过滤至250ml三角瓶中，最初约10ml滤液洗涤三角瓶弃去。吸取滤液50ml于100ml容量瓶中，加浓盐酸3ml，在69～70℃水浴中转化8分钟，冷却后在冷水浴中用20%氢氧化钠溶液中和至中性，加水至刻度、即为测定总糖的检液。总糖测定方法裴林氏液的标定〔即空白滴定〕吸取斐林氏甲、乙两液各5ml于150ml小三角瓶中，预加0.1%的标准葡萄糖液适量〔约8～9ml〕，加蒸馏水10ml,〔以煮沸时裴林氏液仍呈现蓝色者为相宜。如裴林氏液变为无色，说明所加糖已过量，应重做〕。煮沸2分钟后，接着滴加0.1%葡萄糖液至蓝色刚变为无色为终点。接着滴加的操作，应在1分钟内完成。记录所耗标准葡萄糖液的总毫升数A。定糖精确吸取裴林氏甲、乙液各5ml放入150ml三角瓶中。用吸管吸取1ml检液参与三角瓶中，从滴定管参与0.1%标准葡萄糖液约10ml。置电炉上加热煮沸2分钟〔如发觉蓝色消逝，那么表示检液过浓或标准葡萄糖液加过量，应予适当的稀释或取较少的检液重做〕。在沸腾下接着滴加0.1%的标准葡萄糖液至蓝色刚消逝为终点。此操作必需在1分钟内完成。记录所耗标准葡萄糖的总毫升数为B。结果计算以上测定取得精确结果后，可按正式计算检液中的总糖含量。式中：A——空白滴定所耗标准葡萄糖液总毫升数。

B——测定检样时所耗标准葡萄糖液总毫升数。

C——标准葡萄糖液的体积百分浓度。

n——检液的稀释倍数。〔〕

V——滴定时所吸取检液的毫升数。复原糖测定检液的制备精确吸取试样10ml,用蒸馏水约50ml转移入100ml容量瓶中，加中性醋酸铅溶液3～5ml，加蒸馏水定容至刻度，假设泡沫过多难定容，可加数滴酒精或丙酮除泡沫、摇匀，用滤纸过滤至250ml三角瓶中，最初约10ml滤液用于洗涤三角瓶后弃去，接着过滤。用移液管精确吸取滤液50ml于100ml容量瓶中，加脱铅剂12ml，摇匀，静置3～4分钟，沿瓶壁滴加1～2滴脱铅剂，如不再生成浑浊，证明胶铅剂已足够。〔过量的铅会影响分析结果偏低〕。加蒸馏水至刻度，摇匀过滤。用初滤液约10ml洗涤三角瓶弃去。精确吸取滤液50ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容于刻度，摇匀即为复原糖检液。复原糖检测方法复原糖的测定方法及总糖的测定方法一样。结果计算复原糖的结果计算及计算公式及总糖测定的计算的方法和公式一样。蔗糖含量测定发酵液的微生物检查酵母形态的视察视察酵母的形态，主要是为了区分酵母是处于生长旺盛期，还是呈苍老或死亡状态。为生产供应调控依据。酵母细胞形态要求饱满强健，无变形和大小不匀整现象，细胞质匀整浓稠，且不被美蓝等染色剂染色，空泡少，细胞膜薄，用碘液作肝糖染色时，大多数被当成红褐色。仪器和试剂显微镜0.5%次甲基蓝染色剂称取0.5克次甲基蓝，加蒸馏水100ml，加热溶解，贮存于棕色试剂瓶中。检查方法在检查酵母形态时，先取检液一滴于干洁之载玻片上、加上盖玻片，去除空气泡，用吸水纸去多余在外的液体，置显微镜下，先用低倍镜头100～200倍，找出细胞分布匀整之视野，然后转用高倍镜头800～1000倍视察，凡酵母细胞四周尚未发芽，细胞膜较薄而透亮，细胞内的原生质亦透亮，即尚未成为颗粒状态，细胞核较难看出那么为幼龄酵母，假设细胞成单体，或四周已经出芽，细胞膜较厚，原生质中偶有空泡，细胞膜原生质核及细胞匀整充分发育，可以看到细胞内容物成为颗粒状态为成年酵母，假设细胞膜呈绉缩状，原生质收缩，成粒状的组织，那么为老年酵母，假设细胞膜起先分裂，发生自溶，细胞收缩，个体小，酵母蛋白质能屈折光线，颗粒已溶解消逝，可被染色剂染色者那么为死亡或苍老细胞。酵母细胞数的测定酵母数是指每1ml发酵液中所含酵母的个数。仪器及试剂血球计、细胞计数器10%稀硫酸溶液量取浓硫酸30ml，慢慢注入300ml水中，冷却后，再加水稀释至500ml。操作步骤检片制备吸取待检液1ml放入试管内，然后参与9ml10%的稀硫酸，共计10ml，将样品充分摇匀后，用胶头吸管取一滴于血球计上，盖上盖玻片，用双手将其来回推动，使其严密贴紧为止，视察血球计及盖玻片之间不得有空气泡，否那么重做，静置2～3分钟，置显微镜下先用低倍镜100～200倍视察，然后改用450倍视察。检查方法由于血球计盖上盖玻后的容积是必需的，故可依据在显微镜下视察到的细胞数来计算单位体积的微生物总数。血球计通常是一块特别的玻璃片，玻璃片上有四条槽而构成的三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽而隔成两半，每个半边上各刻有一个方格网，每个方格网共分九大格，其中间的大大格〔又称为计数室〕常用于微生物的计数，血球计的构造如图3所示。计数室的刻度一般有两种，一种是大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格。另一种是大方格分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室中哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每一个大方格都由16X25=400个小方格组成。每一大方格边长为1毫米，那么每一个大方格面积为一平方毫米，盖上盖玻片后，载玻片及盖玻片之间的高度为0.1毫米，所以每个计数室〔即大方格〕的体积为0.1立方毫米。左上：正面图左下：侧面图左上：正面图左下：侧面图右：放大后的方格网〔计“红1”～”红5”方格中的菌数〕图3血细胞计数板〔血球计〕在计数的时候，通常数5个中方格的总菌数，求得平均值。再乘上16或25就得出一个大方格的总菌数，然后再换算成1ml发酵液中的总菌数。计数时，连线上的细胞只计右线及下线，而不计左线及上线，芽胞大于母细胞1/2者作两个细胞计，未超过1/2都作一个细胞计。现以一大方格分25个中方格的血球计为例进展计算。设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么一个大方格中的总菌数〔即0.1立方毫米中的总菌数〕为A/5×25×B因为1毫米=1立方厘米=1000立方毫米所以，1毫米中的总菌数=A/5×25×10×1000×B=50000×A×B〔个〕同理，每个大方格分16个中方格时，设五个中方格中的总菌数量为C，菌液稀释倍数为D，那么1毫升菌液中菌的总数为：C/5×16×10×1000×D=3200×C×D〔个〕实例：设五个中方格中的总菌数A为200个，菌液稀释倍数B为10倍，换算成1毫升醪液中的酵母细胞数。以一大方格的25个中方格计算如下：1毫升醪液中的总菌数=50000×A×B=50000×200×10=1亿个/毫升酵母出芽率的测定计算酵母出芽率时，可续用数酵母细胞数制好的样片计算出芽酵母，出芽酵母大于母体一半者按两个酵母计，小于母体一半者，算出芽酵母一个。计数时边线上的酵母只计右线及下线，不计左线及上线。酵母出芽率计算公式为：酵母细胞染色率的测定在生产过程中，生命力强的酵母菌具有旺盛的新陈代谢实力，当无毒染料对细胞进展染色时，即被细胞复原脱色。但苍老和死亡的细胞代谢实力弱或停顿，被染色时无复原实力，所以易被染色。通常把被染色的细胞的百分率叫染色率，表示死亡细胞数量。其测定方法如下：滴一滴0.5%次甲基蓝溶液液于截玻片中心，滴加已稀释10倍的酵母液一滴及次甲基蓝液混合匀整，加盖一盖玻片，在显微镜下视察，计数方法及出芽率一样。并登记3～4个视野中总细胞数和被染色的细胞数，反复三次以求其平均值，按下式计算：

细菌感染率的测定酒母醪和发酵醪时时易为各种细菌所污染，细菌个体太细小，且减光率小，在显微镜下不易视察出来，假设将它染色，减光率加大，就较易视察，故一般以必需体积的检液，用石碳酸复红染色法所检出的细胞数，及酵母细胞总数加细菌数之比值表示醪液的细胞感染百分数。试剂配制香柏油石碳酸复红液吸取5%的碱性复红液10ml及3%的石碳液90ml两者充分混合后，过滤即成。5%碱性复红液：称取碱性复红5克，用乙醇溶解并定容至100ml。3%石碳酸液：称取石碳酸3克，用水溶解定容至100ml。操作步骤检片的制备：取经水和酒精洗干净的载玻片一块，在酒精灯上烧去残酒，然后用胶头吸管取检液一滴平布于载片中心，涂片菌膜面对上在火焰上通过2～3次，使涂片上之菌爱惜牢于载片上，以免染色洗涤时脱落。检液菌体被固定后，加石碳酸复红液数滴于涂片上稍摇动，使整个涂片面上都盖上染色液，于火焰上稍加垫，静置一分钟，然后用水当心冲洗，并用吸水纸吸干，稍停片刻待水汽全去掉后即可进展镜检。检查方法：加香柏油一滴于涂片上，将载片置显微镜下用油镜头视察，先数酵母总数，再数同一视野内被复红染色之球菌，杆菌等细胞数，共数五个视野，最终分别将各次所数得杂菌和酵母数相加后除以细菌总数求出杂菌感染率。计算公式如下：发酵液酒份含量的测定用干净的100ml量筒，量取100ml发酵液倒入500ml三角瓶〔或平底烧瓶中〕，并用清水100ml分数次清洗量筒，其洗液均参与三角瓶中，摇匀，置电炉上安装冷凝管进展加热蒸馏，接取蒸馏液100ml，停顿蒸馏。将蒸馏液充分摇匀，用精细酒精计及温度计测定其酒份和温度，查酒精温度更正表确定发酵液的精确酒精浓度。蒸馏废液含酒份的测定原理接受重铬酸钾比色法，先将废液的酒份蒸馏出来，再用重铬酸钾氧化，使六价铬复原为三价铬而产生绿色之后及标准颜色比拟，求得废液的残酒份，此法测定残酒含量可达0.02%。其反响方程式如下：3CH3CH2OH+2K2Cr2O7+8H2SO43CH3COOH+2Cr2(SO4)3+2K2SO4+11H2O试剂配制0.1%〔V/V〕乙醇标准溶液吸取无水乙醇0.1ml，参与100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，得0.1%〔V/V〕乙醇溶液。2%重铬酸钾溶液称取重铬酸钾2克，用水溶解并稀释至100ml。比重1.84的浓硫酸测定方法标准管的制备在10ml比色管中，按下表参与各溶液编号〔S〕0123450.1%〔V/V〕标准乙醇〔ml〕012345水〔ml〕543210各管中注入2%重铬酸钾溶液1ml，摇匀，沿管壁注入比重1.84的浓硫酸5ml，摇匀。试样管的制备量取蒸馏废液100ml，注入500ml三角瓶中，加200ml水，蒸馏，馏出液用100ml容量瓶精确收集100ml，摇匀。吸取5ml馏出液，注入10ml比色管中，参与2%重铬酸钾溶液1ml，浓硫酸5ml，摇匀，及标准管一起沸水浴中加热10分钟，取出冷却后，及标准管比色。计算废液含酒份式中：S——标准管的编号

0.001——标准书本溶液的浓度〔毫升/100毫升〕

5——吸取馏出液作分析用的毫升数例如：试样管的颜色及编号4的标准管一样，那么

废液酒精含量毫升/100毫升=4X0.001X100/5=0.08试验数据分析及整理表1发酵流加稀糖分析记录锤度〔BX〕pH酸度〔°D〕复原糖〔%〕蔗糖〔%〕总糖〔%〕备注表2酒精连续发酵分析数据记录罐号发酵时间(h)品温(℃)pH酸度(℃)酵母数(亿/ml)出芽率(%)染色率(%)染菌率(%)复原糖(%)总糖(%)酒份(%)蒸馏废液含酒份(%)备注1234568依据试验数据书写试验报告试验报告包括试验的目的和意义，试验装置流程图，数据整理记录表，试验结论及问题探讨等内容。试验结论及问题探讨包括以下内容：发酵率计算上式中0.6479是一公斤单糖理论上产无水酒精的量〔以20℃时为标准〕。发酵周期计算式中：总容积——指发酵成熟醪含酒份最高的罐之前的醪液总容积〔每个罐V=4升〕

流速——指发酵醪在罐中的流速〔约1.0升/小时〕计算发酵速度常数式中：S0——表示发酵稀糖液的复原糖浓度

S——表示发酵t时间后发酵中复原糖浓度发酵液稀释度计算式中：D——发酵液稀释度

f——发酵液流速〔米3/小时〕

V——发酵成熟醪的体积问题探讨依据发酵试验状况，分析影响酒精连续发酵的主要因素有哪些，如何提高发酵率，写出自己的相识和看法。试验留意事项本试验是一综合性的工艺试验，检测工程多，每个小组之间要相互协作才能顺当完成。试验检测数据必需谨慎做好记录，每个小组要负责把本小组的试验数据收集齐，做到检测结果精确可信。每个组在起先试验前，必需谨慎阅读和熟悉所用的分析检测方法后才起先做试验。试验时留意爱惜玻璃仪器，不得损坏，用电炉时要留意用电平安，不得违反试验操作规程。

试验二离子交换法提取谷氨酸试验试验目的熟悉离子交换装置的构造和运用方法。熟悉离子交换法提取谷氨酸的工艺流程。应用离子交换的理论和学问，通过试验，了解影响谷氨酸提取率的几个主要因素。试验原理谷氨酸是两性电解质，是一种酸性氨基酸，等电点为pH3.22，当pH>3.22时，羧基离解而带负电荷，能被阴离子交换树脂交换吸附；当pH<3.22时，氨基离解带正电荷，能被阳离子交换树脂交换吸附。也就是说，谷氨酸可被阴离子交换树脂吸附也可以被阳离子交换树脂吸附。由于谷氨酸是酸性氨基酸，被阴离子交换树脂的吸附实力强而被阳离子交换树脂的吸附实力弱，因此可选用弱碱性阴离子交换树脂或强酸性阳离子交换树脂来吸附谷氨酸。但是由于弱碱性阴离子交换树脂的机械强度和稳定性都比强酸性阳离子交换树脂差，价格又较贵，因此就都强酸性阳离子交换树脂而不选用弱碱性阴离子交换树脂。目前各种味精厂均接受732#强酸性阳离子交换树脂，本试验就是接受732#树脂。谷氨酸溶液中既含有谷氨酸也含有其他蛋白质、残糖、色素等阻碍谷氨酸结晶的存在。通过限制相宜的交换条件，再依据树脂对谷氨酸以及对杂质吸附实力的差异，选择相宜的洗脱剂和限制相宜的洗脱条件，使谷氨酸和其他杂质分别，以到达浓缩提纯谷氨酸的目的。试验装置离子交换装置本试验接受动态法固定床的单床式离子交换装置。离子交换柱是有机玻璃柱，直径为90mm，长为700mm，柱底用玻璃珠及玻璃碎片装置，以防树脂漏出。树脂本试验用苯乙烯强酸性阳离子交换树脂，编号为732#，其性能如下表：732#树脂的主要性能常数交联度粒度〔目〕最高耐热〔℃〕理论交换容量〔mm01/g干树脂〕湿视密度〔g/cm3〕pH范围溶胀率〔%〕水分〔%〕7～860934．50.75～0.850～142.25〔水〕46～52试剂配制上柱交换液谷氨酸发酵液等电点母液，含谷氨酸2%左右。配制方法：取工厂购回的谷氨酸干粉180g溶于约1.5L自来水中，再加进约100ml浓盐酸使谷氨酸粉全部溶解，此时pH值约为1.5，最终稀释至9L。洗脱用碱4%NaOH溶液。其配制方法有两种：40gNaOH溶于1L自来水中。工业用碱配制成4%浓度〔W/W〕,〔约6°Be,相对密度1.04〕。再生用酸6%〔W/W〕盐酸溶液。把大约320ml浓盐酸〔36%含量〕用自来水稀释至2L。配成约4°Be，相对密度1.028的溶液。0.5%茚三酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml丙酮溶液中配制成。离交工艺流程上柱交换液上柱交换液上柱交换水洗杂质及疏松树脂热水预热树脂热碱洗脱↓收集↓———————↓———————↓低流分高流分尾流分〔PH1.5–2.0〕〔PH2.5–3.0〕〔PH9–11〕↓干脆等电点提取谷氨酸在本试验中，低流分和尾流分都弃去不要。试验步骤检查离交柱工作状况。检查阀门，管理是否安装妥当，假设有渗漏，刚好报告。计算上柱量先测量浸水后湿树脂的体积及上柱液总氨当量〔其方法见后面附录〕，再按下式计算上柱量。依据实践，湿树脂试验交换当量为1.2～1.3mg当量/ml湿树脂。上柱交换本试验用顺上柱方式。先把树脂上的水从底阀排走，排至清水高出树脂而5cm左右，同时调整柱底流出液速度，限制其流速为150ml/min左右。然后把上柱液放入高位槽中，开启阀门，进展交换吸附。留意使柱的上，下流速平衡，即不“干柱”也要幸免上柱液溢出离交柱。前期流速为150ml/min左右，后期流速为130ml/min左右。每流出500ml流出液，用PH试纸及波美比重计测量其PH值及浓度，记录下来。连续用茚三酮溶液检查是否有谷氨酸漏出。如有漏出，应减慢流速。上柱液交换完毕，参与1/3树脂体积的清水将未交换的上柱液全部放入树脂中交换。水洗杂质及疏松树脂开启柱底清水阀门，使水从下面入反冲洗净树脂中的杂质，留意不要让树脂冲走。反冲至树脂顶部溢流液清净为止，再把液位降至离树脂面5cm左右，反冲后树脂也被疏松了。热水预热树脂参与树脂体积1倍左右的60～70℃热水至柱上预热树脂，柱下流速限制为150～180ml/min。热碱洗脱把水位降至离树脂面5cm左右，接着参与60～65℃的4%NaOH溶液到柱上进展洗脱，用碱量按下式计算：式中：147——谷氨酸分子量

3——被吸附谷氨酸当量数的倍数

40——NaOH分子量

1.04——4%NaOH的相对密度每收集300ml流