生物学仪器分析红外吸收光谱分析

生物学仪器分析红外吸收光谱分析第1页，共59页，2023年，2月20日，星期六（一）红外吸收光谱分析

分子内部的能级变化比原子复杂；分子除外层电子的运动状态之外，还有原子核间的相对运动（核间振动）和分子绕中心的转动；

第2页，共59页，2023年，2月20日，星期六分子能级的层次：

电子能级------外层价电子跃迁（1~20eV），对应紫外-可见光区,反映价电子能量状态；

振动能级------分子及组成分子的原子的振动（0.05~1eV），对应中红外区，反映分子中价键特性；

转动能级------分子转动（0.05eV以下），对应远红外区，反映分子的大小，键长等；第3页，共59页，2023年，2月20日，星期六较大的能级跃迁时，伴随着较小的能级跃迁，因此，在形成光谱时，较小的能级跃迁形成的谱线叠加在较大的能级跃迁形成的谱线上；所以，电子光谱包含振动光谱和转动光谱；振动光谱包含转动光谱；

电子光谱对应紫外-可见光区；

振动光谱对应红外光区；第4页，共59页，2023年，2月20日，星期六红外吸收光谱实质上是分子振动-转动光谱，它反映分子的振动情况；

当用一定频率的红外光照射某物质的分子时，若该物质分子中的某基团的振动频率与其相对应，此物质就能吸收红外光，产生能级跃迁，形成红外吸收光谱（IR）；第5页，共59页，2023年，2月20日，星期六1、红外光区的划分

红外光是指波长为0.75~1000μm的电磁波，在可见光与微波之间；根据仪器技术与应用的不同，习惯上又把红外光区分为三个区：

区段波长（λ/μm）波数（σ/cm-1）跃迁类型近红外0.75~2.513333~4000O-H,N-H,C-H键的倍频吸收中红外2.5~254000~200分子内的原子振动，分子的转动远红外25~1000200~10分子转动，晶格振动第6页，共59页，2023年，2月20日，星期六2、红外吸收光谱产生的两个条件

红外光谱为分子的振动-转动光谱；红外吸收后，发生分子的振动-转动能级跃迁，因此：

（1）辐射的光子能量与分子发生振动-转动能级跃迁相等

（2）分子的振动必须伴有偶极矩的变化----辐射与分子之间有偶合作用发生，依靠分子偶极矩的变化与红外频率相同来实现电磁振荡与机械振动的偶合；

第7页，共59页，2023年，2月20日，星期六

补充知识-----偶极矩正、负电荷中心间的距离r和电荷中心所带电量q的乘积，叫做偶极矩μ=r×q。它是一个矢量，方向规定为从负电荷中心指向正电荷中心。偶极矩的单位是D。根据讨论的对象不同，偶极矩可以指键偶极矩，也可以是分子偶极矩。分子偶极矩可由键偶极矩经矢量加法后得到。实验测得的偶极矩可以用来判断分子的空间构型。第8页，共59页，2023年，2月20日，星期六3、红外吸收光谱

红外光谱为分子的振动-转动光谱，因此，能级跃迁产生的吸收不是一条谱线，而是许多相隔很近的谱线组成的谱带，具有吸收峰出现的频率范围小，数目多，强度弱，曲线复杂的特点。

红外光谱图是以T-λ曲线或

T-σ（波数）曲线，因而吸收峰向

下。偶极矩的变化越大，吸收越强；

分子极性越大，偶极矩的变化也大，吸收也越强。第9页，共59页，2023年，2月20日，星期六

红外光谱的吸收强度与相应的摩尔吸收系数大小的划分ε>100100>ε>2020>ε>1010>ε>1很强峰（vs）强峰（s）中强峰（m）弱峰（w）第10页，共59页，2023年，2月20日，星期六（二）分子的振动形式

1、双原子分子的振动

由双原子振动方程式可以知道，影响振动频率的直接原因是：*相对原子量（折合）；*化学键的力常数；第11页，共59页，2023年，2月20日，星期六2、多原子分子振动的形式

多原子分子原子数目多，组成分子的键或基团不同，空间结构不同，振动形式复杂，因而其振动光谱比双原子分子复杂得多；

把多原子分子复杂的振动分解为许多简单的基本振动------简正振动；

第12页，共59页，2023年，2月20日，星期六简正振动：分子的质心不变、整体不转动、每个原子都在平衡位置作简谐振动；

*伸缩振动---原子沿键轴方向伸缩，键长发生变化，键角不变（有对称伸缩振动和不对称伸缩振动）；

*变形振动---基团键角发生周期变化，键长不变（有扭曲、摇摆、剪式之分）；第13页，共59页，2023年，2月20日，星期六亚甲基的各种振动（伸缩振动）强吸收2853cm-12926cm-1第14页，共59页，2023年，2月20日，星期六亚甲基的各种振动（变形振动）弱吸收中等吸收面外面内1468cm-1720cm-11250cm-11306cm-1第15页，共59页，2023年，2月20日，星期六

3、分子振动形式与红外吸收

振动的数目称为振动自由度；每个振动自由度相当于红外光谱图上的一个基频吸收带（峰）；

假设分子由n个原子组成，每个原子有3个自由度；除区整个分子的3个平动和3个转动，因此，分子的振动形式有3n-6种；直线形分子有3n-5种；第16页，共59页，2023年，2月20日，星期六

但绝大多数化合物在红外光谱图上出现的吸收峰数小于理论计算数，原因是：

（1）没有偶极矩变化的振动，没有红外吸收；

（2）相同频率的吸收峰发生简并；

（3）仪器无法分辨波数相近的振动；

（4）有些吸收带的频率范围在仪器的检测范围外；第17页，共59页，2023年，2月20日，星期六红外吸收谱带的强度取决于分子振动时偶极矩的变化；偶极矩与分子的对称性有关；振动的对称性越高,振动中分子的偶极矩变化越小,谱带强度也越弱;另外,浓度和溶剂类型也影响吸收。

红外活性分子-----有偶极矩变化的分子，能吸收红外辐射；

非红外活性分子---没有偶极矩变化的分子，不能吸收红外辐射；第18页，共59页，2023年，2月20日，星期六第19页，共59页，2023年，2月20日，星期六（三）红外吸收光谱的基团频率与特征吸收

把代表基团存在，并有较高强度的吸收谱带称为基团频率（特征吸收峰）；

官能团区（基频峰）：位于4000~1500cm-1区间

指纹区（泛频峰）：位于1500~600cm-1区间第20页，共59页，2023年，2月20日，星期六（1）官能团区：位于4000~1500cm-1区间，包括X-H、C=X、C≡X化学键的伸缩振动，是鉴定有机化合物官能团的依据。也叫基团频率区或特征区。比较稀疏,容易辨认。

第21页，共59页，2023年，2月20日，星期六（2）指纹区：位于1500~600cm-1区间，包括C-X化学键的伸缩振动和C-H化学键的弯曲振动。这些振动很容易受到邻近化学键振动的影响，分子结构的微小差异对该区的吸收带有明显的改变，与不同的人具有不同的指纹一样；对于指认结构类似的化合物很有帮助。第22页，共59页，2023年，2月20日，星期六4000~2500cm-1区域：为X-H伸缩振动区；这个区域的吸收，表明含氢原子基团的存在,通常也叫氢键区；

O-H---3650~3200cm-1---醇,酚,酸的重要依据;

N-H---3500~3100cm-1；

第23页，共59页，2023年，2月20日，星期六3000cm-1以下:

R-CH32960cm-12876cm-1

R2-CH22930cm-12850cm-1

R3-CH2890cm-1

（饱和C-H）

3000cm-1以上：

苯环上的C-H3030cm-1

=CH-H上的C-H3010cm-1~3040cm-1;

=CH2上的C-H3085cm-1

≡CH上的C-H3300cm-1（不饱和C-H）

-------以此判断不饱和的C-H;

第24页，共59页，2023年，2月20日，星期六2500~1900cm-1

：三键或积累双键伸缩振动区,主要基团有:(-C≡C-，-C≡N，-C=C=C-，-C=C=O，-N=C=O的反对称伸缩振动)

C≡CH2100~2140cm-1；

R-C≡C-R´2190~2260cm-1;

R-C≡C-R为非红外活性;

C≡N非共轭时2240~2260cm-1；

与芳香核或不饱和键共轭2220~2230cm-1

当分子中含有C,H,N原子时:吸收峰强而尖锐;

当分子中含有O原子时,而且越近,吸收越弱;第25页，共59页，2023年，2月20日，星期六1900~1200cm-1区域：双键伸缩振动区；主要有C=O，C=C，C=N，-NO3的伸缩振动和苯环骨架振动。

C=O1900~1650cm-1,往往是红外光谱中最强的吸收；以此判断酮,醛,酸,酯,酸酐等;

C=C(烯烃)1680~1620cm-1；弱,

单核芳烃1600cm-1和1500cm-1附近,双峰;以此确认芳核;C=N，N=O1675~1500cm-1；第26页，共59页，2023年，2月20日，星期六1500~1300cm-1

：C—H弯曲振动区；

甲基C-H弯曲振动为1375cm-1，鉴定甲基存在；

1300~910cm-1

：单键伸缩振动区；

C-O、C-N、C-F、C-P、C-S、P-O、Si-O等键的伸缩振动和C=S、S=O、P=O等双键的伸缩振动；

910~以下cm-1

：苯环取代区；

苯环的不同取代类型，在该区域产生不同的吸收；第27页，共59页，2023年，2月20日，星期六3、影响基团频率的因素

*内部因素

（1）电子效应：诱导效应、共轭效应和中介效应；都是由化学键的电子分布不均匀引起；

诱导效应（I效应）是由于取代基具有不同的电负性，通过静电作用，引起分子内电子的重新分布，改变键力常数，使基团的特征频率发生位移；第28页，共59页，2023年，2月20日，星期六第29页，共59页，2023年，2月20日，星期六共轭效应（C效应）是共轭体系中，电子云密度平均化，使原有的双键键长增加，键力常数减小，振动频率降低；

中介效应（M效应）是含有孤对电子的原子（如O、N、S等），与多重键（不饱和键）相连时，孤对电子与π电子发生重叠，电子云密度平均化，使原有的双键键长增加，键力常数减小，振动频率降低；

第30页，共59页，2023年，2月20日，星期六（2）氢键的影响

氢键的形成，改变了氢原子周围的力场，造成X-H伸缩振动的力常数减小，使X-H伸缩振动频率向低波数方向移动，吸收强度增加，谱带变宽。

如：羧酸用其气体或非极性溶剂的极稀溶液测定时，吸收峰在1760cm-1（游离的C=O伸缩振动）；若测定液态或固态的羧酸，只在1710处出现一个吸收峰（全部的分子以二聚体形式存在）。

第31页，共59页，2023年，2月20日，星期六（3）振动偶合

两个振动频率相同或相近的基团，具有一个公共原子，由于一个键的振动通过公共原子使另一个键的长度发生变化，形成强烈的振动相互作用；结果是振动频率发生变化：一个向高频移动，另一个向低频移动，形成谱带分裂；

第32页，共59页，2023年，2月20日，星期六（4）费米共振

弱的泛频峰位于强的基频峰附近时，它们的吸收强度常常增加或发生分裂；

如：正丁基乙烯基醚（C4H9-O-C=CH2）中，烯基（非平面摇摆振动810cm-1）的倍频（1600cm-1）与烯基（伸缩振动1620cm-1）发生费米共振，结果在1640cm-1和1613cm-1出现两个强的吸收谱带；第33页，共59页，2023年，2月20日，星期六*外部因素

主要指被测物质的状态和溶剂效应等；

同一物质的分子在不同状态下，由于相互间的作用力是不同的，所得到的光谱也是不一样的；第34页，共59页，2023年，2月20日，星期六分子处于气态，分子间的相互作用很弱，这时可以观察到伴随振动光谱的转动精细结构；液态或固态分子间的作用力较大，在有极性基团存在时，可能发生分子缔合或产生氢键，导致特征吸收带频率、强度和形状有较大的改变；

例如：气态丙酮C=O伸缩振动为1742cm-1；

液态丙酮C=O伸缩振动为1718cm-1；

第35页，共59页，2023年，2月20日，星期六注意：

在溶液中测定红外光谱时，溶剂的种类、溶液的性质及测定温度不同会使同一物质测得的光谱不同；通常在极性溶剂中，溶质分子的极性基团的伸缩振动频率随溶剂极性增加向低波数移动；而且强度加大；因此，在红外光谱测定时要尽量采用非极性溶剂；第36页，共59页，2023年，2月20日，星期六

（四）红外光谱仪

1、色散型红外分光光度计

由光源单色器吸收池检测器记录器等部分

（1）原理第37页，共59页，2023年，2月20日，星期六（2）主要部件

*光源：主要有硅碳棒和能斯特灯；

能斯特灯由稀土元素氧化物烧结而成，直径1~3mm，长为20~50mm，工作温度为1750℃，在高温下导电并发射连续红外辐射；使用前要预热；其特点是寿命长，稳定性好，短波范围使用较好；但价格高、机械强度差；

硅碳棒由碳化硅烧结成，工作温度1200~1400℃，发光面积大，机械强度高，不需要预热，价格低；但使用寿命短；第38页，共59页，2023年，2月20日，星期六*吸收池：玻璃、石英等一般光学材料不能通过红外线，因此，红外光谱分析使用的吸收池为能透过红外线的NaCl、KBr、CsI等制成窗片；

------固体试样通常与以上材料混合压片或夹持在盐片中；

------液体试样可以加注在液体样品槽中；

------气体试样可以使用气体样品槽；

吸收池（尤其是盐窗片）使用时注意防潮；第39页，共59页，2023年，2月20日，星期六单色器：单色器的作用是把通过样品槽和参比槽而进入入射狭缝的复合光色散成为单色光，再照射到检测器上加以测量，用NaCl或KBr晶体或平面衍射光栅制成；

*检测器：红外辐射的频率低，能量小，不能

使普通的光敏感材料发射电子，一般用热电

偶将红外辐射转化为电信号；

*数据处理与显示系统第40页，共59页，2023年，2月20日，星期六2、傅里叶变换红外分光光度计

为新一代红外光谱仪，没有色散元件，主要由光源、迈克尔逊干涉仪、探测器、计算机组成。

基本原理

第41页，共59页，2023年，2月20日，星期六

（五）红外光谱法的应用

红外光谱分析法广泛应用于有机化合物的定性鉴定和结构分析；

合适的样品制备方法是获得高质量光谱图的保证；

第42页，共59页，2023年，2月20日，星期六红外光谱法对试样的要求和制备方法

试样的要求

*要求试样组分的纯度在98%以上，避免各组分的光谱重叠；

*试样中不能含有水分，否则会因水对红外的吸收对测定产生干扰和水腐蚀盐窗；

*试样的浓度和厚度适当，使光谱图中的大多数吸收峰的透射比为10%~80%；第43页，共59页，2023年，2月20日，星期六制样方法

气体样品：在玻璃质的气体样品槽中进行测定；一般都是先将气体样品槽中的空气抽出，再注入样品；气体样品槽的两端由盐窗片组成，以便红外线透过；

液体试样：沸点较低、挥发性强的液体样品，用封闭液体吸收池进行测定（溶液厚度为0.01~1mm）；第44页，共59页，2023年，2月20日，星期六高沸点试样：滴加在盐窗片之间形成液膜，进行测定------液膜法；吸收很强的试样，在厚度很小是依然无法得到满意的谱图时，可以先进行稀释；

固体样品也可以采用溶液的形式进行测定，但溶剂一定要本身没有吸收、不浸蚀盐窗、没有强烈的溶剂化效应;第45页，共59页，2023年，2月20日，星期六固体样品：

压片法：1~2mmg试样与200mgKBr研细混匀，用模具和油压机（5×107~10×107Pa）压成透明薄片（KBr要干燥、研磨粒度小于2微米）；

薄膜法：高分子化合物测定时，加热熔融后涂制或压制成膜或溶解在容易挥发的溶剂中涂在盐片上成膜；第46页，共59页，2023年，2月20日，星期六石蜡糊法：

干燥的试样研细，与液体石蜡（1360cm-1~4000cm-1）混合均匀成糊状，夹在盐片中测定；其它的糊剂还有氟化煤油（4000cm-1~1400cm-1）、六氯丁二烯（4000cm-1~1700cm-1、1500cm-1~1200cm-1）；

三种糊剂分别使用，可以得到完整的红外光谱图；

第47页，共59页，2023年，2月20日，星期六1、定性分析

（1）已知化合物的鉴定

将测得的试样图谱与标准样品图谱进行对比，或与文献图谱对比，峰形、峰位、强度完全一样时，就可以确定为同一种物质；当然要注意，测试条件要求与文献上的图谱获得的条件（试样的物态、结晶状态、溶剂、测定条件、仪器型号等）也是一致的；

（2）官能团定性分析

根据特定官能团有特征吸收峰，判断特定官能团的（存在与否）；第48页，共59页，2023年，2月20日，星期六2未知物结构的分析

红外光谱可以判断分子内部的官能团，确定化合物的类型。分子结构的确定，还要根据试样来源、物化参数及其其它手段的分析资料加以综合。

一般步骤：

（1）准备：进行光谱解析前，对未知物的特征及各种物理参数有比较详尽的了解，以便作为谱图解析的参考与佐证；第49页，共59页，2023年，2月20日，星期六（2）确定未知物的不饱和度

元素分析得到化合物的经验式，由相对分子量得到化学式，从而求出不饱和度；不饱和度有助于缩小化合物的可能范围；

W=1+n4+(n3-n1)/2

n1、n3、n4分别为化合物分子中4价、3价、1价元素原子数目，2价元素不参加计算；

第50页，共59页，2023年，2月20日，星期六

计算结果:

W=0：饱和链状化合物及衍生物；

W=1：链状分子含单一双键或一饱和环；

W=2：有两个双键或一个三键或一个双键加饱和环等；

W=3：有三个双键或一个双键加一个三键等；

W=4：表示有一个苯环或两个双键加一个三键等第51页，共59页，2023年，2月20日，星期六（3）官能团分析：

依据红外谱图中基团频率区和指纹区的信息粗略估计和推测化合物的类别（基团类别和大致的结构）；

（4）图谱解析：

在基团频率区寻找官能团的伸缩振动的特征吸收峰；再根据指纹区的吸收进行确认基团的存在和与其它基团的结合方式；第52页，共59页，2023年，2月20日，星期六

红外吸收光谱分析的几种标准图谱集

（1）Sadtler标准红外光谱图集；

（2）Aldrich红外图谱库；

（3）SigmaFourier红外光谱图库；

（4）分子光谱文献；

（5）“API”红外光谱资料；第53页，共59页，2023年，2月20日，星期六（三）定量分析

红外光谱定量分析理论依据是比尔吸收定律；