综合性实验一 质粒DNA的小量制备和电泳鉴定

综合性实验一质粒DNA的小量制备和电泳鉴定第1页/共29页质粒plasmid质粒是细菌染色体外的环形双链DNA分子，能在宿主细胞内独立自主的进行复制。质粒基因工程中目的基因的运载工具。质粒载体第2页/共29页大小可从1kb到200kb筛选标记多克隆位点酶切位点复制原点第3页/共29页质粒的特性：能独立自主进行复制。

细菌内的共生型遗传因子，能垂直遗传。

能赋予宿主细胞一些表型。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。第4页/共29页质粒的应用质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。第5页/共29页大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。第6页/共29页Visualizationoftopoisomers.Inthisexperiment,allDNAmoleculeshavethesamenumberofbasepairsbutexhibitsomerangeinthedegreeofsupercoiling.BecausesupercoiledDNAmoleculesaremorecompactthanrelaxedmolecules,theymigratemorerapidlyduringgelelectrophoresis.第7页/共29页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于核酸与核蛋白、免疫复合物的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中也常用于LDH、CK等同工酶的检测。第8页/共29页■影响电泳迁移率的因素：FrictionCharge外加电流、电压分子量分子形状分子的等电点VoltageCATHODEANODE+--+第9页/共29页琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术

在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。

第10页/共29页差速离心DIFFERENTIALCENTRIFUGATION离心:利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开

。第11页/共29页二．实验原理第12页/共29页质粒提取原理质粒提取有多种方法，但都包含三个基本步骤：1.培养细菌使质粒扩增2.收集裂解细菌3.分离纯化质粒DNA去除蛋白质去除RNA去除基因组DNA苯酚-氯仿抽提法Rnase消化法？？？第13页/共29页质粒DNA和基因组DNA的区别大小不同变性与复性有差异质粒DNA较小，通常只有基因组DNA分子量的百分之一。基因组DNA容易断裂线性化。第14页/共29页

从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的有：

依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点选择。碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。分离质粒DNA和基因组DNA的方法碱变性法煮沸法羟基磷灰石层析法等第15页/共29页碱裂解法提取质粒的原理应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。

基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。第16页/共29页原理：1.强碱NaOH和SDS裂解细菌，细菌中的质粒DNA和基因组DNA在强碱条件下发生变性。2.怎样去除基因组DNA？

当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，而染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以复性，并形成沉淀，经过离心随细胞碎片一起去除。3.怎样去除蛋白质？

留有质粒DNA的上清，经酚/氯仿去除蛋白质后，用乙醇沉淀DNA，即得到质粒DNA。第17页/共29页三、试剂与仪器Biospin质粒DNA小量提取试剂盒：Resuspensionbuffer,Lysisbuffer,Neutralizationbuffer,washbuffer,Elutionbuffer,RNasesolution,Spincolumns.琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，电泳槽，紫外灯琼脂糖，50XTAE电泳缓冲液，6X点样缓冲液，DNAMarker，溴化乙啶（荧光染料，结合DNA并在紫外线下显示）第18页/共29页四、操作步骤第19页/共29页第20页/共29页ResuspensionBuffer细胞悬浮液LysisBuffer碱裂解液NeutralizationBuffer中和液Spincolumn吸附柱WashBuffer漂洗液ElutionBuffer洗脱缓冲液第21页/共29页2.质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳1)用胶带将洗净、干燥的配胶板的边缘封住，形成一个胶模并水平放置，放入电泳梳。第22页/共29页2)按水平板的长×宽×0.5cm胶厚，量取1×TAE，并按0.8％的浓度称取琼脂糖（agarose），在微波炉或电炉上加热至全熔（清澈透明）。第23页/共29页第24页/共29页3)等凝胶温度降至大约50－60℃以下时，加入1mg/L溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5µg/mL；摇匀并轻快地倒入水平板中，除掉气泡。4)凝固后，将梳子轻轻拔出。5)去掉胶带，将水平板放入加有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。第25页/共29页6)上样Buffer和DNA混匀后点样，记录点样次序。7)在水平板两边的点样孔中分别加入marker即分子量标记。8)盖好电泳槽盖子，选择适当的